GeneXpert MTB/RIF检测MTB及利福平耐药的应用价值

郁大伟 宋华峰 邱文娜 薛婧 郦芳华 胥萍

据WHO统计，新发结核病患者中，有10.2%的患者会出现对至少一种抗结核药物耐药[1]。中国每年新增耐多药结核病(MDR-TB)患者约12万例，其传染性更强、治愈率更低，病死率更高，因此，如何更早、更高效地发现结核病患者、尤其是MDR-TB患者，成为了控制耐药结核病传播的关键[2]。目前，临床上常用的一线抗结核药品为异烟肼、利福平、乙胺丁醇及链霉素，与其他抗结核药品相比，利福平单耐药的发生率较低，可把利福平耐药作为诊断MDR-TB的指征[3]。目前检测耐药结核病的方法中，传统的BACTEC MGIT 960液体培养(简称“MGIT 960”)及改良罗氏药物敏感性试验(简称“药敏试验”)结果虽准确可靠，但检测周期长，易造成诊断延误。亟需寻求能够快速、准确、安全的检测结核分枝杆菌(MTB)及其耐药性的分子诊断技术。笔者对GeneXpert MTB/RIF(简称“GeneXpert”)检测痰标本中MTB及其耐药性的效能进行分析与探讨。

资料和方法

1.研究材料：收集2018年1—12月苏州市第五人民医院收治的疑似肺结核患者的痰标本414份。痰标本由患者按要求自行采集，留痰前先用清水漱口，从肺部深处用力咳出痰液，收集于一次性无菌痰瓶之中，痰液量约3～5 ml。分别采用GeneXpert和MGIT 960技术进行检测。

2.仪器与试剂：GeneXpert试剂盒(美国Cepheid公司)，GeneXpert检测系统(美国Cepheid公司)；MGIT 960培养管(美国BD公司)，MTB快速培养系统(美国BD公司)，分枝杆菌罗氏培养管(珠海贝索生物技术有限公司)。

3.痰涂片抗酸染色：采用珠海贝索生物技术有限公司生产的抗酸染色液试剂盒，按照《结核病实验室标准化操作与网络建设》[4]中的检测要求和操作步骤进行检测。

4.MTB培养及药敏试验：将痰瓶中痰液转移1～2 ml至50 ml离心管中，加入等体积的4%氢氧化纳(NaOH)进行充分液化，漩涡振荡、混匀，静置30 min，加入40 ml pH 6.8的磷酸盐缓冲液(PBS)中和、离心，弃上清。在弃去上清的离心管中加入0.5 ml生理盐水，吹打、混匀。吸取 0.5 ml标本加入MGIT 960培养管中，将接种好的培养管放入仪器中进行培养。MGIT 960培养报阳后，挑取生长良好的菌落，与磨菌管底部的PBS缓冲液混合均匀，配备不同浓度的菌悬液。用接种环沾取1满环约为0.01 ml不同稀释倍数的菌悬液，用划线法均匀涂布于各培养基表面。37 ℃培养，至4周报告结果。若药敏试验培养管上有菌落生长则在4周内可报告结果；若4周内对照培养管上长满菌落而药敏试验培养管内无细菌生长，不能轻易报告“敏感”，因耐药菌常较敏感菌生长缓慢，故需延长培养约1～2周，再观察结果。

5.GeneXpert检测：痰液标本加入2倍样本体积的样本处理液进行液化，拧紧瓶盖，漩涡振荡至少20 s，将混匀后的样本于室温下静置15 min；用无菌移液管吸取液化的样品，直至弯月面在移液管的最低标记之上(注意避免形成气溶胶)，由检测匣的加样孔缓慢加入，盖上检测匣盖子，上机检测。

6.统计学处理：应用SPSS 19.0软件进行统计学分析，计数资料以“率(%)”表示，组间差异的比较采用χ2检验，以P<0.05为差异具有统计学意义。以痰培养药敏试验结果为参照，计算GeneXpert的检测效能指标，各项指标计算方法：敏感度=真阳性例数/(真阳性例数+假阴性例数)×100%；特异度=真阴性例数/(真阴性例数+假阳性例数)×100%；阳性预测值=真阳性例数/(真阳性例数+假阳性例数)×100%；阴性预测值=真阴性例数/(真阴性例数+假阴性例数)×100%；符合率=(真阳性例数+真阴性例数)/总检测人数×100%。一致性检验采用Kappa检验，即：Kappa值≥0.75为一致性较好；0.40≤Kappa值<0.75为一致性一般；Kappa值<0.40为一致性较差。

结 果

1.痰标本阳性检出情况：通过检测414份痰标本，痰涂片阳性检出率为18.6%(77/414)，MGIT 960培养的阳性检出率为31.4%(130/414)，GeneXpert检测的阳性检出率为35.3%(146/414)。GeneXpert和MGIT 960培养的阳性检出率明显高于痰涂片(χ2=29.22，18.09，P值均<0.001)，而GeneXpert的阳性检出率与MGIT 960培养相比，差异无统计学意义(χ2=1.39，P=0.238)。

表1 GeneXpert检测以MGIT 960药敏试验结果为参照检测MTB利福平耐药的效能分析

2.耐药检测情况：GeneXpert检出的146份阳性标本中利福平耐药检出率为9.6%(14/146)，MGIT 960培养阳性的130份痰标本中利福平耐药检出率为9.2%(12/130)，两者之间差异无统计学意义(χ2=0.01，P=0.919)。

3.耐药检测效能评价：99份痰标本同时具有GeneXpert检测和MGIT 960培养的药敏结果，以MGIT 960培养药敏结果为参照，GeneXpert检测MTB利福平耐药的敏感度为81.8%、特异度为98.9%、符合率为97.0%、Kappa值为0.84，见表1。

讨 论

随着分子生物学诊断技术的迅猛发展，PCR 等核酸扩增技术在临床检验中起着越来越关键的作用，这类检测方法具有速度快、敏感度高、效率高等优点，尤其对于结核病的早期诊断具有独特优势。但传统的PCR操作过程较复杂、易出现交叉污染，而出现假阳性的情况，容易使临床对患者的病情出现误诊[5]。此外，PCR 检测对设备的要求高，对操作人员要求也比较高，需经过PCR检测技术的岗前培训。因此，将其在大多数基层医院普及还需要一个过程。目前，随着科技的不断进步，检测设备及手段同步得到发展，GeneXpert检测在全球的开展及接受程度相当广泛和快速，是唯一受到WHO推荐的，用于MTB及利福平耐药快速检测的手段。该方法不易产生气溶胶、不易污染、可检测多种类型的样本、报告周期短、敏感度高、特异度强，一般实验室条件均可满足其要求[6-7]。

本研究结果显示，与痰涂片结果相比，GeneXpert检测和MGIT 960培养阳性检出率明显升高，但两者之间没有差异。进一步分析耐药检测发现，GeneXpert检测和MGIT 960培养对MTB利福平耐药检出率也没有差异，与文献报道结果一致[8-9]。以MGIT 960培养药敏检测结果为参照，GeneXpert检测MTB利福平耐药的敏感度和特异度均较高，分别为81.8%和98.9%，且具有较好的一致性，与文献报道一致[10-12]。

综上，本研究结果表明，GeneXpert在快速检测MTB及利福平耐药方面具有较好的效能。值得注意的是，由于该技术的检测原理是基因扩增技术，扩增的模板是核酸，因此其检测结果不能区分死菌和活菌。所以，在临床检测中会存在GeneXpert检测阳性而培养阴性的相互矛盾结果。总体而言，GeneXpert在早期筛查MTB及利福平耐药时具有较好的效能，且检测时间快，是一种快速、可靠的辅助诊断方法。