两种分子诊断技术对提高结核病病原学 检测阳性率的评价研究

宋红焕 邵燕 李燕 李国莉 陈诚 竺丽梅 陆伟

结核病是严重危害人类健康的呼吸道传染疾病[1]，目前结核病的主要诊断手段有实验室检测、影像学及免疫学辅助检查。萋-尼染色法因操作简单、成本低、生物安全要求较低等因素，目前仍广泛应用于各级结核病定点诊疗机构，但因其敏感度较低，痰标本中结核分枝杆菌只有大于10 000条/ml方可检出，敏感度仅为30%左右[2-3]。如此，一方面造成漏诊误诊，导致患者的病情加重；另一方面患者的传染期延长，对人群健康造成了极大的威胁。所以，采用适宜的技术提高病原学阳性率对于患者的早期诊断和治疗非常重要。2017年7月，江苏省在全省范围内推广分子生物学检测技术，主要是基因芯片、线性探针、半巢式全自动实时荧光定量PCR检测技术(以下简称：GeneXpert技术)、恒温扩增技术检测结核分枝杆菌复合群核酸技术(以下简称：恒温扩增技术)。其中基因芯片与线性探针主要用于市级结核病实验室进行耐药结核病筛查；GeneXpert与恒温扩增技术主要用于县(区)级结核病实验室检测，以发现结核病患者。因2016—2017年江苏省部分县(区)根据项目要求陆续开展分子检测，故本文选取2015年数据为基线，与2018年数据进行比较，综合评价GeneXpert技术与恒温扩增技术两种分子生物学检测技术对结核病病原学阳性率的提高水平及其检测效能。

材料和方法

一、资料来源

从《中国疾病预防控制结核病专报系统》常规监测报表肺结核患者登记情况统计获取江苏省23个使用GeneXpert技术的县(区) [以下简称A类县(区)]和46个使用恒温扩增技术的县(区)[以下简称B类县(区)]2018年活动性结核病患者信息(单纯结核性胸膜炎除外)，以及全年确诊活动性肺结核患者的总例数。同样的方法获取2015年(尚未推广分子生物学技术)两类县(区)数据。

二、江苏省县(区)级定点医院分子检测技术使用情况

A类县(区)：江苏省23个使用GeneXpert技术的县区，该类县(区)临床路径为结核病疑似患者首先进行痰涂片检测，涂片阴性且综合影像学、免疫学、临床症状等高度疑似结核病患者采用GeneXpert技术进行病原学检测，同时进行痰培养检测。

B类县(区)：江苏省46个使用恒温扩增技术的县(区)，该类县(区)临床路径为结核病疑似患者首先进行痰涂片检测，涂片阴性且综合影像学、免疫学、临床症状等高度疑似结核病患者采用恒温扩增技术进行病原学检测，同时进行痰培养检测。

两类县(区)结核病疑似患者综合细菌性检测、影像学、免疫学、临床症状等确诊是否为结核病患者；病原学阳性患者为痰涂片、痰培养或分子生物学3种技术联合检测，任何一种技术阳性者(分子检测阳性且培养阳性者计入分子检测阳性数，不重复记录在培养阳性患者人数中)。为方便统一比较，故在2015年和2018年数据中均将单纯结核性胸膜炎排除，并剔除病理检测阳性患者，分别获取两类县(区)2018年病原学阳性患者例数，以及3种方法分别检出阳性患者例数与阳性率，并与2015年(尚未推广分子生物学技术)的相关数据进行比较。比较两类县(区)2015与2018年病原学阳性率以及2018年推广分子生物学技术后，两类县(区)的病原学阳性率。

三、试剂与材料

痰培养采用L-J罗氏固体培养法，培养基购自珠海贝索生物技术有限公司，GeneXpert技术试剂盒购自美国赛沛公司，恒温扩增检测技术试剂盒购自广州迪澳生物科技有限公司，试剂均由江苏省疾病预防控制中心统一招标采购下发至各个县(区)。

四、统计学处理

使用SPSS 25.0统计软件进行数据的统计分析，计数资料的组间比较采用卡方检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、两类县(区)不同年份临床确诊肺结核患者的病原学阳性率比较

比较两类县(区)2015年与2018年病原学阳性率，发现两种分子生物学技术对肺结核诊断病原学阳性率均有明显的提高，其中A类县(区)病原学阳性率从27.8%提高至52.9%，B类县(区)阳性率从33.0%提高至50.6%。两类县(区)2015年与2018年病原学阳性率差异均有统计学意义(χ2=1270.00，P=0.000;χ2=860.00，P=0.000);分别比较2015年和2018年两类县(区)的病原学阳性率， 2015年B类县(区)病原学阳性率高于A类县(区),差异有统计学意义(χ2=80.10，P=0.000)；2018年推广分子生物学技术后， A类县(区)病原学阳性率高于B类县(区)，差异有统计学意义(χ2=10.60，P=0.001)。

二、2018年两类县(区)活动性肺结核患者不同检测技术病原学检测阳性率

2018年A类县(区)确诊活动性肺结核患者8176例，其中病原学阳性患者4327例(包括涂片3117例，痰培养116例，GeneXpert技术1094例)，病原学阳性率为52.9%(涂片38.1%，痰培养1.4%，GeneXpert 13.4%)，GeneXpert技术检测阳性占总病原学阳性的比率为25.3%(1094/4327)；B类县(区)确诊活动性肺结核患者12 196例，其中病原学阳性患者6171例(包括涂片4823例，痰培养461例，恒温扩增技术887例)病原学阳性率分别为50.6%(涂片39.5%，痰培养3.8%，恒温扩增技术7.3%)，恒温扩增技术检测阳性占总病原学阳性的比率为14.4%(887/6171)，见表2。

讨 论

近些年恒温扩增技术和GeneXpert两种分子生物学检测技术在基层实验室得到了普遍推广[4]，恒温扩增技术通过聚合酶及特异性引物在恒温条件下对标本中结核分枝杆菌复合群核酸片段进行特异性扩增, 扩增产物与核酸染料结合后发出检测信号由此判断标本中是否存在病原体,该技术具有较高的敏感度和特异度[5-6]。GeneXpert技术使用全自动半巢式实时荧光定量PCR，该技术针对结核分枝杆菌利福平耐药基因rpoB基因区设定引物、探针，扩增荧光检测其是否发生基因突变，检测标本中是否含有结核分枝杆菌及是否对利福平耐药[7]。近年来国内多中心试验验证评估结果显示，GeneXpert技术检测结核病的敏感度为96%～99%，特异度为86%～90%[8]，恒温扩增技术检测结核病的敏感度为83%～89%，特异度为92%～94%[5]。

表1 两类县(区)不同年份临床确诊肺结核患者的病原学阳性率统计

表2 2018年两类县(区)活动性肺结核患者不同检测技术病原学检测阳性率统计

本研究中主要关注两种技术在临床诊断中病原学阳性率的提高，使用恒温扩增技术的县(区)阳性率从33.0%提高至50.6%，使用GeneXpert技术的县区病原学阳性率从27.8%提高至52.9%，分析2018年两类县区病原学阳性率发现两种技术对当地的病原学阳性率均有一定程度提高，GeneXpert技术与恒温扩增技术占总病原学阳性比率分别为25.3%与14.4%，其次2018年相比于2015年，两类县(区)的痰涂片阳性率也有一定程度的提高，A类县区由27.8%提高至38.1%，B类县区由33.0%提高至39.5%，另外涂阴患者的痰培养对病原学阳性率也有部分贡献，故痰涂片、痰培养、分子检测三种检测技术联合应用对两类县区病原学阳性率的明显提高有重要意义。

总之，两种分子生物学检测技术具有安全、高效、准确的特点，为结核病的早诊断、早治疗提供了新依据[9],各级实验室可因地制宜选取适宜的技术开展结核病分子生物学检测。

另外，分子生物学可检测结核分枝杆菌核酸，但是不能区别死菌和活菌，故建议在实际工作中同步开展痰培养，一方面提高结核病诊断能力，另一方面也为后期菌种鉴定与药物敏感性试验做准备。细菌学方法与分子生物学技术联合诊断、相互补充，可以为临床诊断获得较高的病原学阳性率，有利于对患者顺利开展进一步诊疗。