新型前列腺癌标志物对PSA灰区的临床应用研究

张志昱 昂小杰 周奇 陈卫国 欧阳骏 张江磊

前列腺恶性肿瘤（Prostate Cancer,PCa）是一种严重危害老年男性健康的恶性肿瘤[1]，我国PCa的发病率平均每年增长4.7%，是增长最快的男性肿瘤（2000—2011年）[2]。前列腺特异性抗原（Prostate-Specific Antigen,PSA）是应用广泛的PCa早期诊断指标[3-4]，然而在总PSA处于4～20 ng/mL时，穿刺阳性率较低。因此探索更加敏感、特异的新型前列腺癌生物标志物对提高PCa的早期诊断和筛查具有重要意义[5-7]。前列腺癌特异性甲基化位点（PCA-M）检测是针对中国前列腺癌人群研究的一种新型生物标志物，通过检测目标基因甲基化水平，评估受检者患前列腺癌的风险[8]。然而，PCA-M的预测效果仍待临床进一步检验。

1 对象与方法

1.1 研究对象

从2018年6月至9月，筛选本院PSA在（4～20）ng/mL的前列腺穿刺患者，取得知情同意后，收集其年龄、PSA、f/t PSA、PSAD、DRE、MRI诊断等数据，并在穿刺前留取50 mL前列腺按摩后尿液以检测PRKY和TGIF2LY基因甲基化水平。本实验共入组41例患者，其中年龄（55～84）岁，平均年龄（68.49±7.72）岁，PSA（0.74～19.38）ng/ml，平均PSA（9.98±4.33）ng/mL。根据病理结果，18例确诊为PCa，23例诊断为前列腺增生（Benign Prostate Hyperplasia,BPH）。

1.2 基因检测

由无锡正则精准医学检验有限公司提供技术支持，针对PRKY和TGIF2LY基因的特异性测序引物和单链DNA模板结合，然后加入酶混合物和底物混合物，向反应体系中加入1种dNTP,如果它刚好能和DNA模板的下一个碱基配对，则会在DNA 聚合酶的作用下，添加到测序引物的3’末端，同时释放出一个分子的焦磷酸（PPi）。在ATP硫酸化酶的作用下，生成的PPi可以和APS结合形成ATP。在荧光素酶的催化下，生成的ATP又可以和荧光素结合形成氧化荧光素，同时产生可见光。通过CCD光学系统即可获得一个特异的检测峰，峰值的高低则和相匹配的碱基数成正比。甲基化位点的甲基化水平分布值为0%～100%，当PRKY甲基化水平高于（0～3）%或TGIF2LY甲基化水平低于（84～100）%水平时，提示前列腺癌风险因素增多。

1.3 前列腺穿刺方法

患者取左侧卧位，曲腿抱膝，臀部突出床边。先行DRE检查，后将涂抹耦合剂后的双平面探头行前列腺扫描，获取前列腺大小、异常回声等信息。碘伏常规消毒后，改用端扫式探头行前列腺穿刺，采用12针穿刺方法，即前列腺底部、体部左右各两针，前列腺尖部左右各一针，前列腺外周带底部、体部、尖部左右各一针，共12针。每个穿刺标本分别放入不同的标本瓶中送病理检查。术后用碘伏纱布填塞伤口止血。

1.4 统计学方法

本实验采用Graphpad Prism 7进行统计学分析。计量资料表达方式以（），采用Mann-Whitney U检验，当P＜0.05时差异具有统计学意义。计数资料表达方式以（%），采用卡方检验，当P＜0.05时差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PCa与BPH患者各参数的比较

本研究病理确诊18例PCa患者，23例BPH患者，分别研究PCa和BPH两组患者的临床资料(见表1)，结果发现，PCa和BPH两组患者间年龄、PSA及PRKY甲基化无明显差异（P＞0.05）。而DRE、MRI诊断PCa组阳性率高于BPH组，f/t PSA及TGIF2LY甲基化水平PCa组明显低于BPH组，PSAD则PCa组数值显著高于BPH组（P均＜0.05）。

2.2 诊断符合率比较

诊断符合率是指真阳性与真阴性样本量与总样本量之比，用于反映诊断质量的高低。根据PCa患者与BPH患者临床资料的差异，分别将DRE、MRI诊断、f/t PSA、PSAD与TGIF2LY甲基化水平的符合率相比较（见表2），虽然TGIF2LY甲基化水平的符合率最高，为75.61%，但与其他因素（f/t PSA为73.17%，PSAD为65.85%，DRE为68.29%，MRI诊断为68.29%）相比无明显统计学差异（P＞0.05）。

表1 PCa与BPH患者一般情况比较（）

表1 PCa与BPH患者一般情况比较（）

表2 诊断符合率比较

3 讨论

前列腺癌是一种严重危害老年男性健康的恶性肿瘤[1]，我国通常采用PSA来进行筛查。由于PSA在4～20 ng/mL区间的穿刺阳性率较低，且易受感染、尿道操作的影响，因此常结合PSA相关指标来判断患癌风险。

研究表明，f/t PSA≤0.16时，恶性可能性较大[9]。本研究也发现，PCa组患者的f/t PSA的均值显著低于BPH组的患者（0.11±0.04vs.0.17±0.06，P＝0.0036）。Feng ZJ等[10]的研究认为，PCa患者PSAD显著高于BPH患者，且PSAD≥0.15时恶性可能大。本研究证实了这一说法[（0.25±0.14）ng/ml2vs.（0.16±0.08）ng/ml2，P＝0.0155]。张恒等[11]认为DRE对于筛查PCa具有重大意义。本研究中，PCa组DRE阳性率为83.33%，BPH组DRE阳性率为43.48%，差异有统计学意义（P＝0.0094）。有研究显示，多参数磁共振在诊断前列腺癌方面有重要作用[12]。本研究中，PCa组MRI诊断怀疑为前列腺恶性肿瘤者为14例，怀疑为良性病变者4例，而BPH组MRI诊断怀疑为阳性者9例，怀疑为阴性者14例，差异有统计学意义（P＝0.0133）。

目前较热门的PCa生物标记物为PCA3，国内外大量临床研究[6-7]认为PCA3对于临床诊断早期PCa有一定的价值。然而，PCA3主要检测尿液中的mRNA，mRNA稳定性较差，同时PCA3收费较贵，应用较为局限。PCA-M主要检测目标DNA甲基化水平差异，稳定性好，费用较低，具有一定的应用前景。目前研究[8]已筛选出2个差异甲基化基因（PRKY和TGIF2LY）。本研究发现TGIF2LY甲基化水平在PCa患者中较低（P＜0.05），而PRKY甲基化水平在PCa及BPH患者中未见明显差异（P＞0.05）。

通过研究诊断符合率来比较f/t PSA、PSAD、DRE、MRI诊断与TGIF2LY甲基化水平的差异。结果表明，各参数间无明显差异（P＞0.05），然而TGIF2LY甲基化水平的符合率最高，为75.61%，而f/t PSA、PSAD、DRE、MRI诊断分别为73.17%、65.85%、68.29%、68.29%。说明TGIF2LY甲基化水平的诊断效能优于PSA相关的指标，但是仍有待于进一步扩大样本量来论证其诊断效能。

4 结语

本研究发现PCA-M中的TGIF2LY甲基化水平与前列腺癌密切相关，虽然TGIF2LY甲基化水平的诊断符合率与其他指标无显著差异，但TGIF2LY甲基化水平的诊断符合率数值仍高于f/t PSA、PSAD、DRE及MRI诊断，具有成为筛查PCa工具的潜能。由于样本容量较小，TGIF2LY甲基化水平的诊断效能仍待进一步扩充样本量后检验。