E-钙黏蛋白和基质金属蛋白酶9在妊娠滋养细胞肿瘤中的表达及与患者临床特征的关系

张晓英，董小敏，王飞鹏，张新选

咸阳市中心医院1妇科，2检验科，陕西 咸阳712000

妊娠滋养细胞肿瘤是胚胎的滋养细胞层发生恶变而形成的恶性肿瘤，以滋养层细胞异常增生为特征[1]。蛋白水解酶和细胞黏附分子在肿瘤的浸润和转移过程中发挥着重要的作用，肿瘤细胞对细胞外基质的降解以及细胞黏附分子的表达异常或功能缺失是肿瘤发生局部浸润和转移的重要影响因素[2-3]。E-钙黏蛋白（E-cadherin）是钙依赖性黏附蛋白家族中的重要成员，是维护正常上皮细胞形态和结构完整性的重要因子，能够介导同种细胞的黏附；当E-cadherin的表达水平下降时，肿瘤细胞极易发生脱落，进而促进肿瘤细胞的浸润与转移[4]。基质金属蛋白酶9（matrix metalloproteinase 9，MMP9）能够降解细胞外基质，具有促进血管生成、肿瘤生长及调节细胞迁移的作用，在肿瘤的浸润与转移过程中发挥着重要的作用[5]。本研究通过检测E-cadherin和MMP9在妊娠滋养细胞肿瘤组织中的表达水平，分析妊娠滋养细胞肿瘤组织中E-cadherin与MMP9表达的相关性及其与患者临床特征的关系，旨在为妊娠滋养细胞肿瘤的诊断与治疗提供参考依据，现报道如下。

1 对象与方法

1.1 研究对象

选取2016年2月至2018年4月咸阳市中心医院收治的82例妊娠滋养细胞肿瘤患者作为观察组。纳入标准：①经病理学检查确诊为妊娠滋养细胞肿瘤；②术前未接受过化疗；③无妇科炎性疾病；④有可供检测的肿瘤组织标本。排除标准：①合并非妊娠性绒毛膜癌；②合并其他部位恶性肿瘤；③合并免疫系统疾病；④合并严重的心、肝、肾功能不全。82例妊娠滋养细胞肿瘤患者的年龄为19～51岁，平均年龄为（34.87±8.62）岁；病理类型：侵蚀性葡萄胎53例，绒毛膜癌29例；手术类型：全子宫切除术62例，子宫病灶切除术20例。收集经手术切除的妊娠滋养细胞肿瘤组织标本。另外，选取同期于咸阳市中心医院行人工流产术的39例健康女性的正常早孕绒毛组织标本作为对照。39例健康女性的年龄为20～42岁，平均年龄为（35.17±6.72）岁。妊娠滋养细胞肿瘤患者与健康女性的年龄比较，差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。本研究经医院医学伦理委员会审批通过，患者及家属均对本研究知情同意并签署知情同意书。

1.2 主要试剂与仪器

兔抗人E-cadherin多克隆即用型抗体购自武汉博士德生物工程有限公司，稀释浓度为1∶100；鼠抗人MMP9单克隆抗体购自美国Santacruz公司，稀释浓度为1∶50。二氨基联苯胺（diaminobenzidine，DAB）显色试剂盒购自美国AMRESCO公司；免疫组织化学染色试剂盒购自美国Roche公司。

1.3 免疫组织化学染色方法

采用免疫组织化学染色法检测E-cadherin和MMP9在妊娠滋养细胞肿瘤组织和正常早孕绒毛组织中的表达水平。所有组织标本均经10%的福尔马林溶液固定，采用石蜡包埋进行连续切片，切片厚度为4 μm，将切片置于60～65℃的烘箱中烘烤4 h。采用二甲苯脱蜡，采用梯度乙醇进行水化，磷酸盐缓冲液（phosphate buffered solution，PBS）冲洗3次，每次5 min，高压修复抗原，修复时间为2 min，取出抗原修复盒，自然冷却后，再次使用PBS冲洗3次，应用3%的双氧水灭活内源性过氧化物酶，从而阻断内源性过氧化物酶的活性；加入50 μl一抗（兔抗人E-cadherin多克隆即用型抗体），置于湿盒中，4℃环境下孵育过夜，然后加入二抗（鼠抗人MMP9单克隆抗体），室温下静置20 min，应用DAB显色液染色；自来水冲洗后应用苏木素复染，再用自来水冲洗返蓝，梯度乙醇脱水，二甲苯透明后应用中性树胶进行封固，光镜下观察E-cadherin和MMP9的染色情况。以试剂公司提供的已知阳性表达的石蜡切片作为阳性对照，选取PBS代替一抗作为阴性对照。

1.4 免疫组织化学染色结果判定标准

E-cadherin和MMP9的免疫组织化学阳性染色结果均表现为细胞质和细胞膜中出现棕黄色颗粒。所有病理切片均由两名高年资病理科医师采用双盲法进行评定。依据染色强度评分：无色计0分，浅黄色计1分，棕黄色计2分，棕褐色计3分[6]。依据阳性细胞所占百分比评分：阳性细胞所占百分比为0计0分，阳性细胞所占百分比＜15%计1分，阳性细胞所占百分比为15%～50%计2分，阳性细胞所占百分比＞50%计3分。将染色强度评分与阳性细胞所占百分比评分相乘，＞3分为E-cadherin或MMP9表达为阳性，≤3分为E-cadherin或MMP9表达为阴性。

1.5 观察指标

比较E-cadherin和MMP9在妊娠滋养细胞肿瘤组织和正常早孕绒毛组织中的表达水平，分析妊娠滋养细胞肿瘤组织中E-cadherin、MMP9的表达水平与患者临床特征的关系，并分析妊娠滋养细胞肿瘤组织中E-cadherin与MMP9表达的相关性。

1.6 统计学方法

采用SPSS 19.0软件对数据进行统计分析。计数资料以例数和率（%）表示，组间比较采用χ2检验。相关性采用Spearman相关性分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同组织中E-cadherin和MMP 9阳性表达率的比较

妊娠滋养细胞肿瘤组织中E-cadherin的阳性表达率为56.10%（46/82），明显低于正常早孕绒毛组织的97.44%（38/39），差异有统计学意义（χ2=21.276，P＜0.01）。妊娠滋养细胞肿瘤组织中MMP9的阳性表达率为93.90%（77/82），明显高于正常早孕绒毛组织的30.77%（12/39），差异有统计学意义（χ2=54.155，P＜0.01）。

2.2 不同临床特征妊娠滋养细胞肿瘤患者妊娠滋养细胞肿瘤组织中E-cadherin和MMP9阳性表达率的比较

不同年龄、肿瘤直径、前次妊娠是否存在葡萄胎的妊娠滋养细胞肿瘤患者妊娠滋养细胞肿瘤组织中E-cadherin和MMP9的阳性表达率比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。TNM分期为Ⅲ～Ⅳ期、子宫肌层浸润深度≥2/3、有肺转移的妊娠滋养细胞肿瘤患者妊娠滋养细胞肿瘤组织中E-cadherin的阳性表达率均明显低于TNM分期为Ⅰ～Ⅱ期、子宫肌层浸润深度＜2/3、无肺转移的妊娠滋养细胞肿瘤患者，差异均有统计学意义（χ2=12.588、12.345、18.049，P＜0.01）。TNM分期为Ⅲ～Ⅳ期、子宫肌层浸润深度≥2/3、有肺转移的妊娠滋养细胞肿瘤患者妊娠滋养细胞肿瘤组织中MMP9的阳性表达率均明显高于TNM分期为Ⅰ～Ⅱ期、子宫肌层浸润深度＜2/3、无肺转移的妊娠滋养细胞肿瘤患者，差异均有统计学意义（χ2=15.546、12.429、14.392，P＜0.01）。（表1）

表1 不同临床特征妊娠滋养细胞肿瘤患者妊娠滋养细胞肿瘤组织中E-cadherin和MMP 9的阳性表达情况（n=82）

2.3 妊娠滋养细胞肿瘤组织中E-cadherin与MMP9表达的相关性

对妊娠滋养细胞肿瘤患者妊娠滋养细胞肿瘤组织中E-cadherin和MMP9表达的相关性进行Spearman相关性分析，结果显示，E-cadherin和MMP9在妊娠滋养细胞肿瘤组织中的表达呈负相关（r=-0.605，P＜0.01）。

3 讨论

妊娠滋养细胞肿瘤均来自胚胎滋养细胞，根据滋养层细胞的侵蚀能力、有无绒毛、增生程度及其他生物学特性，其可分为葡萄胎、侵蚀性葡萄胎、绒毛膜癌和胎盘部位滋养细胞肿瘤[1]，其中，胎盘部位滋养细胞肿瘤是指来源于胎盘种植部位的一种特殊类型的滋养细胞肿瘤，葡萄胎仅局限在子宫腔内，属于非恶性妊娠滋养细胞肿瘤，而绒毛膜癌和侵蚀性葡萄胎能够浸润子宫肌层或向其他器官转移，为恶性妊娠滋养细胞肿瘤[7-10]。浸润和转移是恶性肿瘤最显著、最本质的生物学特征，细胞黏附为恶性肿瘤细胞发生浸润和转移过程中的重要环节，而参与细胞间相互作用的细胞黏附分子是肿瘤细胞恶性行为的基础[11-13]。E-cadherin可通过影响上皮-间充质转化过程，减少细胞间质中的纤维组织成分，促进细胞间质中细胞骨架成分的降解，从而为肿瘤细胞的转移提供基础[14]。E-cadherin对细胞的生长、分化及形态改变具有重要的调节作用[15]。此外，E-cadherin蛋白和基因表达水平的变化与肿瘤的浸润和转移密切相关，其在多种肿瘤中低表达或不表达[16-17]。本研究结果显示，妊娠滋养细胞肿瘤组织中E-cadherin的阳性表达率明显低于正常早孕绒毛组织（P＜0.01），临床分期为Ⅲ～Ⅳ期、浸润子宫肌层深度≥2/3、有肺转移的妊娠滋养细胞肿瘤患者妊娠滋养细胞肿瘤组织中的E-cadherin阳性表达率明显低于临床分期为Ⅰ～Ⅱ期、浸润子宫肌层深度＜2/3、无肺转移的患者，表明E-cadherin在妊娠滋养细胞肿瘤组织中的阳性表达率较低，且E-cadherin的阳性表达率与妊娠滋养细胞肿瘤患者的某些临床特征可能有关，提示E-cadherin能够导致肿瘤细胞分裂，从而促进妊娠滋养细胞肿瘤细胞的浸润与转移，影响疾病的发生与发展，分析其原因主要是因为随着E-cadherin表达水平的逐渐降低甚至消失，细胞间的黏附能力降低甚至缺失，细胞的黏附与分化受到影响，肿瘤细胞极易自母体脱离从而促进肿瘤细胞的浸润与转移。

基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）家族是一组具有相似结构和功能的蛋白水解酶，与肿瘤的发生、发展密切相关，MMP9是MMP家族中的重要成员，其能够降解基底膜和细胞外基质的Ⅳ型胶原蛋白，使基底膜的完整性遭到破坏，使肿瘤细胞能够突破基底膜屏障，进而协助肿瘤细胞向周围组织浸润及转移，在肿瘤细胞的侵袭与转移的过程中发挥着重要作用[18-21]。此外，MMP9还能够使组织结构发生重塑并诱导新生肿瘤血管的形成从而导致肿瘤的发生、发展、侵袭和转移。本研究结果显示，妊娠滋养细胞肿瘤组织中MMP9的阳性表达率明显高于正常早孕绒毛组织（P＜0.01），且TNM分期为Ⅲ～Ⅳ期、子宫肌层浸润深度≥2/3、有肺转移的妊娠滋养细胞肿瘤患者妊娠滋养细胞肿瘤组织中MMP9的阳性表达率均明显无肺转移的妊娠滋养细胞肿瘤患者（P＜0.01），说明MMP9在妊娠滋养细胞肿瘤组织中的阳性表达率较高，且参与了妊娠滋养细胞肿瘤细胞的浸润和转移，可作为评估妊娠滋养细胞肿瘤恶性程度的有效指标之一。本研究还对E-cadherin和MMP9在妊娠滋养细胞肿瘤组织中的表达情况进行了相关性分析，结果显示，E-cadherin和MMP9在妊娠滋养细胞肿瘤组织中的表达呈负相关（r=-0.605，P＜0.01），提示两者可能存在拮抗作用，并协同参与了妊娠滋养细胞肿瘤的浸润与转移。分析其原因可能是因为MMP9能够通过下调E-cadherin的表达从而诱发上皮-间充质转化，进而促进妊娠滋养细胞肿瘤的发展。

综上所述，妊娠滋养细胞肿瘤组织中E-cadherin的表达明显下调，MMP9的表达明显上调，且其阳性表达情况可能与妊娠滋养细胞肿瘤患者的TNM分期、子宫肌层浸润深度和肺转移情况关系密切。因此，检测E-cadherin与MMP9有助于评估恶性妊娠滋养细胞肿瘤的恶性程度。后续相关研究可以探讨E-cadherin、MMP9表达与恶性妊娠滋养细胞肿瘤患者生存预后的关系。