survivin和MCM7在甲状腺乳头状癌组织中的表达及其与患者临床特征的关系

李伟，李永红，江晖

天门市第一人民医院肿瘤科，湖北 天门431700

甲状腺癌是内分泌系统中常见的恶性肿瘤。有研究发现，在不同的国家和地区，甲状腺癌的构成比大体相同，其中，甲状腺乳头状癌尤为常见，约占甲状腺癌的60%～94%[1-2]。甲状腺乳头状癌的发生可能与基因变异、遗传、碘摄入异常等因素有关，多发于女性，易出现淋巴结转移。目前，外科手术、131I治疗和促甲状腺激素（thyroid stimulating hormone，TSH）抑制治疗等为治疗甲状腺乳头状癌的主要方法，但手术往往会损伤喉返神经和甲状旁腺，不仅会改变患者的音调，严重时还会引起患者发生窒息，对患者的生活质量造成严重的影响[3-4]。因此，除了应提高手术操作的技术，避免造成上述损伤外，还应寻求更为灵敏的生物学指标，以用来区分甲状腺乳头状癌和甲状腺良性肿瘤，并观察是否出现淋巴结转移，从而为是否需要进行手术治疗或选择合适的手术方案提供依据。存活蛋白（survivin）是一种穿梭蛋白，与细胞周期密切相关。有研究发现，survivin在正常组织中不表达，而在恶性肿瘤组织中高表达[5]。微小染色体维持蛋白 7（minichromosome maintenance protein 7，MCM7）是一组与脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）复制密切相关的蛋白，为保证遗传物质精确传递至子代，在一个细胞周期中DNA仅能复制一次，因此，当DNA复制完成，MCM7就会出现磷酸化，以确保其只进行一次复制。但也有研究表明，MCM7在恶性肿瘤组织中过表达，促使DNA出现多次复制，从而导致肿瘤发生[6-7]。本研究采用了免疫组织化学染色法检测survivin和MCM7在甲状腺乳头状癌组织中的表达情况，并分析其与颈部淋巴结转移的关系，从而探讨二者在甲状腺癌乳头状癌中的诊断价值，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2013年1月至2017年12月天门市第一人民医院收治的经外科手术切除且石蜡包埋的甲状腺疾病患者，并取得甲状腺病变组织标本。纳入标准：①术前未进行放化疗、免疫治疗和生物学治疗等；②临床资料完整；③术后均经病理学检查确诊。排除标准：①术后复发；②合并远处脏器转移；③初次手术后原发灶有肿瘤组织残留。根据纳入、排除标准，本研究共纳入120例甲状腺疾病（50例甲状腺乳头状癌、35例甲状腺腺瘤、35例结节性甲状腺肿）患者。50例甲状腺乳头状癌中，男10例，女40例；年龄为21～70岁，平均年龄为（42.1±5.4）岁；有淋巴结转移34例，无淋巴结转移16例；TNM分期：Ⅰ～Ⅱ期15例，Ⅲ～Ⅳ期35例。35例甲状腺腺瘤患者中，男7例，女28例；年龄为22～69岁，平均年龄为（42.4±5.1）岁。35例结节性甲状腺肿患者中，男8例，女27例；年龄为21～70岁，平均年龄为（42.0±4.9）岁。3组患者的性别和年龄比较，差异均无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。

1.2 主要抗体与试剂

兔抗人survivin和MCM7多克隆抗体均购自北京博奥森生物技术有限公司，免疫组织化学染色试剂盒、二氨基联苯胺（diaminobenzidine，DAB）显色试剂盒、苏木素、柠檬酸钠抗原修复液均购自武汉博士德生物工程有限公司。

1.3 免疫组织化学染色方法

术后采用免疫组织化学染色方法检测survivin和MCM7在3种甲状腺病变组织中的表达情况。具体方法：取出组织标本，采用石蜡包埋进行连续切片，置入40%的乙醇中，然后水浴40℃，4 min，进行展开，置于60℃烘箱中进行烘片。采用二甲苯脱蜡20 min，采用梯度乙醇进行水化，采用柠檬酸钠抗原修复液对survivin和MCM7进行修复，然后加入3%的双氧水，室温10 min，从而阻断内源性过氧化物酶的活性。磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）冲洗，加入5%的羊血孵育30 min，除去封闭液，加入一抗，置于4℃冰箱过夜，次日取出并使用PBS冲洗，加入DAB显色剂，再次使用PBS冲洗终止显色，使用蒸馏水冲洗，盐酸乙醇分化，乙醇脱水干燥，镜下观察。

1.4 免疫组织化学染色结果判断

免疫组织化学阳性染色结果表现为细胞内出现棕黄色颗粒。survivin阳性表达于细胞质中，MCM7阳性表达于细胞核和细胞质中。根据染色强度进行评分：无色计0分，浅黄色计1分，棕黄色计2分。依据阳性细胞所占比例进行评分：阳性细胞所占比例为0～5%计0分，阳性细胞所占比例为6%～25%计1分，阳性细胞所占比例为26%～50%计2分，阳性细胞所占比例为51%～75%计3分。将染色强度评分和阳性细胞所占比例评分相加，＞2分为阳性表达，≤2分为阴性表达[8]。

1.5 统计学方法

采用SPSS 16.0软件对数据进行统计分析。计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析；计数资料以例数和率（%）表示，组间比较采用χ2检验或Fisher确切概率法。相关性分析采用Pearson相关性分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同类型甲状腺病变组织中survivin和MCM7的表达情况

3种类型甲状腺病变组织中survivin和MCM7的阳性表达率比较，差异均有统计学意义（χ2=61.911、62.393，P＜0.01）。甲状腺乳头状癌组织中survivin和MCM7的阳性表达率均高于甲状腺腺瘤和结节性甲状腺肿组织，差异均有统计学意义（P＜0.05）。结节性甲状腺肿组织中survivin和MCM7的阳性表达率均低于甲状腺腺瘤组织，差异均有统计学意义（P＜0.05）。（表1、图1）

表1 不同类型甲状腺病变组织中survivin和MCM 7的阳性表达情况的比较[n（%）]

图1 不同类型甲状腺病变组织中survivin和MCM7的表达情况（免疫组织化学染色，×200）

2.2 不同临床特征甲状腺乳头状癌患者甲状腺乳头状癌组织中survivin和MCM7的表达情况

不同性别、年龄、肿瘤直径、TNM分期、包膜是否完整、淋巴结转移情况甲状腺乳头状癌患者甲状腺乳头状癌组织中survivin的表达情况比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。不同性别、年龄、包膜是否完整甲状腺乳头状癌患者甲状腺乳头状癌组织中MCM7的表达情况比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。肿瘤直径＞2 cm、TNM分期为Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴结转移甲状腺乳头状癌患者甲状腺乳头状癌组织中MCM7的阳性表达率均高于肿瘤直径≤2 cm、TNM分期为Ⅰ～Ⅱ期、无淋巴转移患者，差异均有统计学意义（χ2=5.255、4.233、8.589，P＜0.05）。（表2）

2.3 相关性分析

对甲状腺乳头状癌患者甲状腺乳头状癌组织中survivin和MCM7表达的相关性进行Pearson相关性分析，结果显示，survivin与MCM7在甲状腺乳头状癌组织中的表达呈正相关（r=0.612，P＜0.01）。（表3）

表2 50例不同临床特征甲状腺乳头状癌患者甲状腺乳头状癌组织中survivin和MCM 7的阳性表达情况

表3 甲状腺乳头状癌组织中survivin和MCM 7表达的相关性

3 讨论

近年来，甲状腺癌的发病率逐年增加，引起了国内外科研工作者的广泛关注。影响甲状腺乳头状癌发生的因素有很多，包括肿瘤直径、分化程度、是否浸润血管等。其治疗失败的主要原因是肿瘤细胞发生了侵袭与转移[9]。survivin是一种凋亡抑制蛋白，在细胞的增殖、浸润和转移方面均起着重要的作用。大量研究表明，survivin在恶性肿瘤（如乳腺癌、喉鳞状细胞癌）中过表达，其能够抑制caspase 7和caspase 9的活性，从而抑制肿瘤细胞的凋亡，参与细胞周期的调控，与肿瘤的发生和预后密切相关[10-12]。本研究结果显示，survivin在甲状腺乳头状癌组织中的阳性表达率高于甲状腺腺瘤和结节性甲状腺肿组织（P＜0.05），与刘松[13]的研究结果一致，提示survivin表达水平的升高促使细胞异常增生并向恶性方向转化。本研究分析了survivin的阳性表达情况与甲状腺乳头状癌患者临床特征的关系，结果显示，其可能与患者的性别、年龄、肿瘤直径、包膜是否完整、淋巴结转移和TNM分期均无关。而与王海莹[14]的研究结果不同，其研究结果发现survivin在甲状腺乳头状癌组织中的阳性表达情况与患者的淋巴结转移可能有关，分析其原因可能是由于本研究纳入的样本数量较少有关。

MCM7是细胞周期调控过程中的主要成分，参与细胞DNA的复制。本研究通过免疫组织化学法检测其在3种甲状腺病变组织中的表达情况，结果显示，MCM7在甲状腺乳头状癌组织中的阳性表达率为90.0%，高于甲状腺腺瘤组织中的28.6%和结节性甲状腺肿组织中的8.6%。Haruki等[15]通过免疫组织化学法检测微小肺腺癌组织中MCM7的表达情况，结果显示，MCM7的表达情况与肺腺癌分型、淋巴结转移情况可能有关，可以用来评估肺腺癌患者的预后。Almadori等[16]研究结果显示MCM7过表达与喉癌的发生有关，可以将其作为预测喉癌患者预后的分子生物学标志物。本研究通过分析MCM7与甲状腺乳头状癌患者临床特征的关系发现，MCM7的阳性表达可能与患者的性别、年龄、包膜是否完整无关，而可能与TNM分期、肿瘤直径、淋巴转移情况密切相关，提示其在甲状腺乳头状癌和甲状腺良性肿瘤的鉴别方面具有重要的临床意义。进一步进行Pearson相关分析，结果显示，survivin和MCM7在甲状腺乳头状癌组织中的表达呈正相关，提示二者存在协同或者相互促进的关系。

综上所述，survivin和MCM7的高表达可能是甲状腺乳头状癌发生发展中重要的一个环节，为临床甲状腺乳头状癌和甲状腺良性肿瘤的鉴别提供依据。