BRAF调节RAF/MEK/ERK信号通路在莫替沙尼治疗甲状腺癌中的作用

周东，何艳平，李恒平，黄卫东

湖北医药学院附属襄阳市第一人民医院普通外科，湖北 襄阳441000

甲状腺癌是一种常见的内分泌系统恶性肿瘤，其发病率逐年升高[1]，发病机制尚不明确，主要是环境因素和机体自身相互作用所引起。碘的摄入不足或过量、放射性碘的大量接触，以及颈部放射线照射等，均可导致甲状腺细胞的异常分裂及癌变，使促甲状腺激素异常分泌，最终导致甲状腺结节恶变为甲状腺癌，严重威胁人类的健康和生命[2-3]。因此，及时有效地监测甲状腺癌的病理过程，给予有效的药物化疗，可明显改善病情。莫替沙尼是一种高选择性的激酶抑制剂，可作用于影响肿瘤血管形成和生长的血管内皮生长因子受体及血小板衍生生长因子受体等，还可作用于某些基因突变所导致的甲状腺癌和其他恶性肿瘤[4-5]。本研究主要通过构建与人类甲状腺癌生物学特性相近的裸鼠甲状腺癌动物模型，并给予莫替沙尼治疗，旨在探讨莫替沙尼对小鼠甲状腺癌的治疗过程，以及迅速加速纤维肉瘤蛋白（rapidly accelerated fibrosarcoma，RAF）家族中的BRAF所诱导的RAF激酶/丝裂原活化的细胞外信号调节激酶（mitogen activated extracellular signal regulated kinase，MEK）/细胞外信号调节激酶（extracellular signal regulated kinase，ERK）信号通路的作用。

1 材料与方法

1.1 材料

90只BALB/C雄性裸鼠（18～20 g）购于北京维通利华实验动物技术有限公司，小鼠胚胎成纤维细胞系NIH3T3 HOOK3-RET所构建的稳定的甲状腺癌细胞株购于中国科学院细胞库，莫替沙尼购于上海经科化学科技有限公司，多克隆抗体BRAF、RAF、MEK、ERK、核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）、β-肌动蛋白（β-actin，ACTB）均购于美国Santa Cruz生物技术有限公司，二抗山羊抗兔免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）碱性磷酸酶以及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（cysteinyl aspartate specific proteinase 3，caspase 3）活性检测试剂盒均购于上海碧云天生物技术有限公司。Prime Script®RT试剂盒和SYBR Premix Ex TaqTMⅡ试剂盒均购于日本TaKa-Ra生物技术有限公司。

1.2 BALB/C裸鼠皮下移植甲状腺癌模型的构建

选用由小鼠胚胎成纤维细胞系NIH3T3 HOOK3-RET所构建的稳定的甲状腺癌细胞株，构建BALB/C裸鼠皮下移植甲状腺癌模型[6]。在无特定病原体动物（specific pathogen free，SPF）级动物实验室进行BALB/C裸鼠饲养，12 h/12 h昼夜循环光照，平均温度为（22.4±2.6）℃。采用含15%胎牛血清的杜尔贝科改良Eagle培养基（dulbecco’s modified Eagle medium，DMEM），37℃、5%CO2条件下适应性培养NIH3T3 HOOK3-RET细胞7天，待细胞长满80%时，用0.25%胰蛋白酶消化液消化、离心，并配制成单细胞悬液，调整细胞浓度为1×107/ml。于BALB/C裸鼠的颈背部皮下注射100 μl细胞悬液。每隔1天称量裸鼠的体重，使用精密卡尺测量裸鼠的肿瘤体积。

1.3 实验动物的分组和处理

采用随机数字表法将90只BALB/C裸鼠随机分为对照组、模型组和治疗组，每组30只。治疗组和模型组BALB/C裸鼠在成功构建皮下移植甲状腺癌模型后，分别给予莫替沙尼50 mg/kg和0.9%氯化钠溶液50 mg/kg腹腔注射治疗1个月，对照组BALB/C裸鼠未构建皮下移植甲状腺癌模型，给予0.9%氯化钠溶液50 mg/kg腹腔注射治疗1个月。

1.4 caspase3活性检测试剂盒检测caspase3的活性

提取BALB/C裸鼠甲状腺癌组织蛋白，按照caspase 3活性检测试剂盒说明书进行甲状腺癌组织caspase 3活性检测。实验重复3次，取平均值。

1.5 蛋白质印迹法（Westernblot）检测不同组织中相关蛋白的相对表达量

提取治疗组、模型组BALB/C裸鼠甲状腺癌组织蛋白和对照组BALB/C裸鼠甲状腺组织总蛋白，调整各组蛋白的浓度总量为30 μg/μl。各组蛋白样品在10%的十二烷基硫酸钠（sodium dodecylsulfate，SDS）聚丙烯酰胺凝胶中进行凝胶电泳和转膜，加入大鼠多克隆抗体BRAF、RAF、MEK、ERK、NF-κB、ACTB和二抗。使用电化学发光（electrochemiluminescence，ECL）显色剂显色，采用Bio-Pro凝胶成像分析仪成像，对各泳道条带进行灰度扫描，得出相应蛋白的相对表达量，并采用Quantity One软件进行分析。

1.6 实时荧光定量PCR检测不同组织中相关基因mRNA的相对表达量

采用Trizol法提取治疗组、模型组BALB/C裸鼠甲状腺癌组织和对照组BALB/C裸鼠甲状腺组织RNA，进行RNA逆转录，合成cDNA。采用实时荧光定量聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）进行不同组织中相关基因的扩增，比较不同组织中相关基因mRNA的相对表达量。采用2-ΔΔCt法计算目的基因mRNA的相对表达量。

1.7 免疫组化法检测不同组织中相关蛋白的平均光密度

取治疗组、模型组BALB/C裸鼠甲状腺癌组织和对照组BALB/C裸鼠甲状腺组织石蜡切片标本，用5%脱脂奶粉室温封闭40 min，加入单克隆抗体BRAF、RAF、MEK、ERK，碱性磷酸酶二抗4℃孵育。磷酸盐缓冲液（phosphate buffered solution，PBS）清洗后加入链霉菌抗生素蛋白-过氧化物酶（streptavidin-perosidase，SP）和二氨基联苯胺（diaminobenzidine，DAB），恒温显色封片。用10倍和40倍物镜显微镜观察蛋白的表达情况。BRAF、RAF、MEK、ERK阳性表达：细胞内出现棕黄色颗粒。根据免疫组化图片测量治疗组、模型组甲状腺癌组织和对照组甲状腺组织中BRAF、RAF、MEK、ERK蛋白表达的平均光密度。

1.8 统计学方法

采用SPSS 18.0软件分析数据。计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，多组间两两比较采用q检验。计数资料以例数表示。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同组织中caspase3活性的比较

治疗组BALB/C裸鼠的甲状腺癌组织中caspase 3活性为（1.74±0.12）U，高于模型组BALB/C裸鼠的甲状腺癌组织的（0.82±0.09）U和对照组BALB/C裸鼠的甲状腺组织的（1.12±0.06）U，差异均有统计学意义（P＜0.05）；模型组BALB/C裸鼠的甲状腺癌组织中caspase 3活性低于对照组BALB/C裸鼠的甲状腺组织，差异有统计学意义（P＜0.05）。

2.2 不同组织中相关蛋白相对表达量的比较

治疗组和模型组BALB/C裸鼠的甲状腺癌组织中NF-κB蛋白的相对表达量低于对照组BALB/C裸鼠的甲状腺组织，BRAF、RAF、MEK、ERK蛋白的相对表达量均高于对照组BALB/C裸鼠的甲状腺组织，差异均有统计学意义（P＜0.05）；治疗组BALB/C裸鼠的甲状腺癌组织中NF-κB蛋白的相对表达量高于模型组，BRAF、RAF、MEK、ERK蛋白的相对表达量均低于模型组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。（表1）

表1 不同组织中相关蛋白相对表达量的比较（±s）

表1 不同组织中相关蛋白相对表达量的比较（±s）

注：a与对照组比较，P＜0.05；b与模型组比较，P＜0.05

治疗组（n=10）0.74±0.06a b 0.81±0.09a b 1.16±0.10a b 0.69±0.08a b 0.89±0.08a b 0.63±0.05 0.77±0.11 0.93±0.08 0.53±0.06 1.26±0.06 0.92±0.07a 1.40±0.12a 1.37±0.14a 1.25±0.12a 0.72±0.09a BRAF RAF MEK ERK NF-κB对照组（n=10） 模型组（n=10）指标

2.3 不同组织中相关基因mRNA相对表达量的比较

治疗组和模型组BALB/C裸鼠的甲状腺癌组织中NF-κB mRNA的相对表达量低于对照组BALB/C裸鼠的甲状腺组织，BRAF mRNA、RAF mRNA、MEK mRNA、ERK mRNA的相对表达量均高于对照组BALB/C裸鼠的甲状腺组织，差异均有统计学意义（P＜0.05）；治疗组BALB/C裸鼠的甲状腺癌组织中NF-κB mRNA的相对表达量高于模型组，BRAF mRNA、RAF mRNA、MEK mRNA、ERK mRNA的相对表达量均低于模型组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。（表2）

表2 不同组织中相关基因mRNA相对表达量的比较（±s）

表2 不同组织中相关基因mRNA相对表达量的比较（±s）

注：a与对照组比较，P＜0.05；b与模型组比较，P＜0.05

指标BRAF mRNARAF mRNAMEK mRNAERK mRNANF-κB mRNA 1.00±0.00 1.00±0.00 1.00±0.00 1.00±0.00 1.00±0.00 1.48±0.07a 1.56±0.10a 1.39±0.12a 1.38±0.11a 0.67±0.09a 1.37±0.09a b 1.27±0.11a b 1.14±0.08a b 1.19±0.06a b 0.88±0.08a b对照组（n=10） 模型组（n=10） 治疗组（n=10）

2.4 不同组织中相关蛋白表达的平均光密度的比较

治疗组和模型组BALB/C裸鼠的甲状腺癌组织中BRAF、RAF、MEK、ERK蛋白的平均光密度均高于对照组BALB/C裸鼠的甲状腺组织，差异均有统计学意义（P＜0.05）；治疗组BALB/C裸鼠的甲状腺癌组织中BRAF、RAF、MEK、ERK蛋白的平均光密度均低于模型组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。（表3）

表3 不同组织中相关蛋白表达的平均光密度的比较（±s）

表3 不同组织中相关蛋白表达的平均光密度的比较（±s）

注：a与对照组比较，P＜0.05；b与模型组比较，P＜0.05

指标BRAF RAF MEK ERK 0.58±0.06 0.63±0.04 0.73±0.07 0.65±0.05 1.63±0.17a 1.44±0.23a 1.37±0.14a 1.59±0.13a 1.38±0.15a b 0.95±0.11a b 1.08±0.21a b 1.26±0.16a b对照组（n=10） 模型组（n=10） 治疗组（n=10）

3 讨论

甲状腺癌主要表现为甲状腺内出现质硬、位置固定的肿块，伴有耳、肩等处疼痛和局部淋巴结及远处器官转移等[7]。研究显示，甲状腺癌对一般化疗药物不敏感，常规的化疗主要是对快速增长的肿瘤细胞进行杀灭。莫替沙尼作为一种新型靶向激酶抑制剂，可以直接作用于由某些突变基因所导致的甲状腺癌，并抑制肿瘤血管的形成和生长[4-5]。

RAF/MEK/ERK细胞信号转导通路在机体炎性反应、氧化应激、细胞增殖等生理病理过程中具有重要的作用[8]。BRAF基因属于RAF家族成员，是丝裂原激活蛋白激酶（mitogen activated protein kinase，MAPK）信号转导通路的重要成分之一。MAPK级联是细胞膜至细胞核的信号转导组件，主要由RAS GTPase介导激活细胞外的有丝分裂和分化信号[9-10]。当细胞外信号分子转导或引发机体刺激及应激时，BRAF下游MAP激酶激酶激酶（mitogen activated protein kinase kinase kinase，MAPKKK）发挥作用，BRAF蛋白磷酸化后诱导激活MAPK信号转导通路，并激活其下游MEK，磷酸化的MEK通过其磷酸化苏氨酸/酪氨酸残基的双特异功能，激活其下游底物ERK，进而影响细胞的增殖和分化[11-13]。NF-κB是磷脂酰肌醇-3-羟激酶（phosphatidylinositol 3-hydroxy kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，PKB，又称AKT）和RAS/RAF/MEK/ERK下游的主要效应靶蛋白，可调节细胞凋亡基因的转录及凋亡过程[9-11]，最终引起凋亡蛋白caspase 3活化和细胞凋亡[12-15]。

本研究结果显示，治疗组BALB/C裸鼠的甲状腺癌组织中caspase 3活性高于模型组BALB/C裸鼠的甲状腺癌组织和对照组BALB/C裸鼠的甲状腺组织（P＜0.05），模型组BALB/C裸鼠的甲状腺癌组织中caspase 3活性低于对照组BALB/C裸鼠的甲状腺组织（P＜0.05），说明给予BALB/C甲状腺癌裸鼠莫替沙尼药物治疗后，可以加速甲状腺癌组织中甲状腺癌细胞的凋亡，对甲状腺癌细胞产生一定的凋亡促进作用。本研究结果显示，治疗组和模型组BALB/C裸鼠的甲状腺癌组织中NF-κB蛋白和mRNA的相对表达量均低于对照组BALB/C裸鼠的甲状腺组织（P＜0.05），BRAF、RAF、MEK、ERK蛋白及BRAF mRNA、RAF mRNA、MEK mRNA、ERK mRNA的相对表达量，以及BRAF、RAF、MEK、ERK蛋白的平均光密度均高于对照组BALB/C裸鼠的甲状腺组织（P＜0.05）；治疗组BALB/C裸鼠的甲状腺癌组织中NF-κB蛋白、NF-κB mRNA的相对表达量均高于模型组，BRAF、RAF、MEK、ERK 蛋白及BRAF mRNA、RAF mRNA、MEK mRNA、ERK mRNA的相对表达量，以及BRAF、RAF、MEK、ERK蛋白的平均光密度均低于模型组（P＜0.05），说明BALB/C裸鼠发生甲状腺癌病变时，BRAF及RAF/MEK/ERK信号通路参与了甲状腺癌的发生发展过程。莫替沙尼可以通过调节BRAF表达及其所诱导的RAF/MEK/ERK信号通路加速细胞凋亡信号通路NF-κB蛋白和基因的表达，进而加速诱导甲状腺癌细胞的凋亡过程，有效抑制肿瘤细胞的增殖分化，起到一定的药物化疗效果。

综上所述，BRAF及其所诱导的RAF/MEK/ERK信号通路在甲状腺癌的发生、发展及治疗过程中起到一定的调控作用，莫替沙尼可以通过调控BRAF和RAF/MEK/ERK信号通路来促进甲状腺癌细胞的凋亡，起到治疗甲状腺癌的作用。但莫替沙尼对临床治疗甲状腺癌的疗效及莫替沙尼对甲状腺癌的主要治疗靶点还需进一步研究。