海藻糖酶在谷氨酸发酵过程中的应用

(中粮生化能源(龙江)有限公司，黑龙江 齐齐哈尔 161100)

随着谷氨酸发酵水平的不断提高，谷氨酸发酵产酸率可达180～200 g/L，糖酸转化率为68%～70%。抑制发酵过程中副产物的产生，提高糖酸转化率成为提高谷氨酸生产水平的一个新的研究方向。笔者在研究中发现：在高渗透压、高温、高寒及干燥失水等不利条件下，谷氨酸菌体会分泌海藻糖保护自身细胞，使碳源转化为海藻糖，并逐渐积累[1-2]，最高质量浓度可达10 g/L，降低了糖酸转化率，致使发酵液中残糖质量分数偏高，对下游工序造成不利影响。添加海藻糖酶以提高糖酸转化率的研究在文献中已有阐述，但在实际生产中应用不多，笔者主要在谷氨酸发酵生产过程中添加海藻糖酶，并对数据进行对比分析，总结海藻糖酶在提高糖酸转化率及降低发酵液残糖质量分数等方面所起的作用。

1 海藻糖简介

1.1 海藻糖分子结构

海藻糖是两个葡萄糖分子以α，α-1，1键连接成的非还原性的双糖，分子结构对称，无半缩醛基，因此无还原性，也无变旋光性。发酵液中的海藻糖理化性质较为稳定，不能被菌体直接利用，但能够在偏酸性条件下被海藻糖酶水解，一分子海藻糖可水解成两分子的具有还原性的葡萄糖，分子结构式[2-3]为

1.2 海藻糖在菌种生产过程中的代谢途径

海藻糖是微生物代谢过程中的副产物，由于产谷氨酸菌体具有特殊通透性的细胞膜结构，微生物体内生产的海藻糖随着谷氨酸和其他副产物一起排放到胞外。随着发酵过程的进行，发酵菌体的不断增长，海藻糖质量分数呈上升趋势，最大积累量达到10～12 g/L。

海藻糖在生物体内的主要代谢流程为海藻糖的生物合成是以6-磷酸葡萄糖和UDP-葡萄糖为底物，在6-磷酸海藻糖合成酶催化下形成6-磷酸海藻糖，再经6-磷酸海藻糖磷酸脂酶作用脱去磷酸基，产生海藻糖[4-6]。发酵初期，发酵液中的海藻糖非常少；随着菌体进入对数增长期，海藻糖得以逐渐积累；进入产酸期后，海藻糖释放加速，海藻糖质量分数呈不断上升趋势，通过多批次发酵罐次的检测跟踪，在28 h左右海藻糖质量分数达到峰值[7-9]，海藻糖代谢途径为

2 海藻糖酶介绍及应用

2.1 原 理

海藻糖酶是一种海藻糖水解酶，将其加入到一定质量浓度的海藻糖溶液(或含有海藻糖的氨基酸发酵液)中，将海藻糖水解成葡萄糖，以提高糖酸转化率[10]。由于发酵后期海藻糖积累量较高且染菌风险较低，故选择后期进行添加，并通过测定葡萄糖的质量分数来判断酶的作用效果。利用四效蒸发器对加酶发酵液进行浓缩，再进行分离，分析浓缩发酵液及分离母液中各残糖组分，总结海藻糖酶对下游谷氨酸提取的影响。

2.2 设备及试剂

2.2.1 菌 种

L-谷氨酸温度敏感型菌种FN-08，中粮生化能源(龙江)有限公司保藏。

2.2.2 仪器与设备

YP2001N电子天平，上海精密科学仪器有限公司；DK-98-II电热恒温水浴锅，天津市泰斯特仪器有限公司；LC-1200高效液相色谱仪，日本岛津公司；微量呼吸减压仪，上海科技大学机电厂。

2.2.3 试 剂

1 mol/L H2SO4；1 mol/L NaOH；液体海藻糖酶(1×105U/mL)，杰能科(中国)生物工程有限公司提供；标准海藻糖，上海恒信化学试剂有限公司；葡萄糖标准品、麦芽糖标准品、麦芽三糖标准品和麦芽四糖标准品，美国Sigma公司；醋酸-醋酸钠缓冲液(PH 5.0)，上海甄准生物科技有限公司。

2.3 实验步骤

2.3.1 色谱条件

色谱柱，Bio-rad Aminex 87C；检测器，视差折光检测器(RID)；柱温85 ℃；流速0.6 mL/min；检测器温度40 ℃；进样量5 μL；流动相为纯水。

2.3.2 样品的制备

将样品用双层滤纸进行过滤，充分过滤掉微小颗粒，以免堵塞仪器管路和色谱柱。

2.3.3 HPLC法测定海藻糖的质量浓度

分别加入质量浓度为10 g/L的葡萄糖标准品溶液、海藻糖标准溶液、麦芽糖标准品溶液、麦芽三糖标准品溶液和混合溶液，根据标准品的保留时间对葡萄糖、海藻糖和麦芽糖、麦芽三糖进行分析。将测量样品稀释10倍后用高效液相色谱法测定转化液中海藻糖的质量浓度[11-13]。

2.3.4 绘制发酵海藻糖积累曲线

通过对发酵过程中海藻糖的质量浓度进行测量，绘制海藻糖积累曲线，便于在下步实验中选择添加海藻糖的时间。从0 h开始，使用2.3.1所述的HPLC法每隔4 h测定一次海藻糖质量浓度。在28 h时海藻糖的积累量最高，故下一步实验中选择在24 h时添加海藻糖酶，如图1所示。

图1 海藻糖积累曲线Fig.1 Trehalose accumulation curve

2.3.5 加酶发酵液中海藻糖质量浓度的测定

进行4组平行试验，分别标号为试验1～4，在发酵至24 h时，加入海藻糖酶0.005～0.01 g/L。为了消除原料、操作及培养条件等因素的影响，选择不添加海藻糖酶的发酵罐作为空白对照罐。使用2.3.1所述的HPLC法每2 h测定一次海藻糖质量浓度。

2.3.6 发酵结束后残糖及主要组分质量浓度的测定

使用HPLC法测定发酵结束后残糖及主要组分海藻糖、葡萄糖、异麦芽糖和潘糖的质量浓度，并分析。

2.3.7 浓缩发酵液及分离母液中残糖及组分质量浓度的测定

将未添加海藻糖酶发酵液和加酶发酵液分别用四效蒸发器浓缩，取浓缩液样品，将未加海藻糖酶的浓缩发酵液标记为“浓缩液-空白”，将加海藻糖酶的浓缩发酵液标记为“浓缩液-加酶”；再分别用分离机分离，取分离母液，将未加酶浓缩发酵液分离后母液标记为“母液-空白”，将加酶浓缩发酵液分离后母液标记为“母液-加酶”。使用HPLC法测定发酵结束后残糖及主要组分海藻糖、葡萄糖、异麦芽糖和潘糖的质量浓度，并分析[14]。

2.3.8 发酵液中谷氨酸质量浓度的测定

使用微量呼吸减压仪测定添加海藻糖酶与未添加海藻糖酶发酵样品产酸情况，吸取0.5 mL样品定容至100 mL，吸取1 mL本稀释样液加入反应瓶主室(侧室中预先加0.5 mL质量浓度为0.25 g/L的大肠杆菌脱羧酶液)再加入1 mL pH 5.0的醋酸-醋酸钠缓冲液，振荡反应，直至反应柱液面不再升高，读取数值并计算结果。

3 试验结果对比

3.1 海藻糖降低情况

进行4组实验，每组实验的对照组均为同期未加海藻糖酶的发酵罐海藻糖质量浓度，平均质量浓度为11.2 g/L。由于实验1与实验2未取加酶前样品，无法确切得知海藻糖降低水平，但放罐时海藻糖质量浓度分别为3.13，3.58 g/L，与对照组(同期未加海藻糖酶发酵罐放罐时海藻糖的质量浓度)相比分别降低68.3%和68%。实验3与实验4放罐海藻糖质量浓度分别为2.95 g/L和3.27 g/L，比28 h时分别降低76.8%和74%，比对照组分别降低73.6%和70.7%。并从图4中可看出：约33.3%～50%的海藻糖是在加酶后2 h内降解，2 h后降解速率变慢，至放罐时发酵液中残留量3 g/L左右，如图2所示。图2中“对照组”为未添加海藻糖酶放罐样品。

图2 添加海藻糖酶对海藻糖残留质量分数的影响Fig.2 The effect of adding trehalase on trehalose residues

3.2 放罐残糖水平

发酵结束时，残糖主要成分为海藻糖、异麦芽糖及潘糖，其中可发酵的葡萄糖属于微量水平，质量浓度为0.5 g/L。发酵液中添加海藻糖酶后，虽然放罐时海藻糖仍然是质量浓度最高的残糖，但其水平与未添加海藻糖酶的发酵液相比由79%下降至57%左右，具体结果见图3。

图3 发酵结束时残糖各组分的质量浓度Fig.3 The content of residual sugar components after downstream treatment

3.3 下游处理过程中残糖变化

由于发酵液浓缩，未加海藻糖酶发酵液中的海藻糖质量浓度大幅提高，而加酶样品中海藻糖质量浓度仅为未加酶浓缩液的10%，说明海藻糖酶将大部分海藻糖转化为葡萄糖被菌体利用，并且能极大的降低残糖质量浓度。加酶浓缩液及加酶母液的海藻糖水平比空白样低，而葡萄糖质量浓度则略有升高，可知海藻糖酶在升温浓缩过程中仍保留一定活力，同时也可以推断由于发酵的温度低于40 ℃，一定程度上抑制了海藻糖酶的活力，在放罐时仍残留一定量海藻糖酶[15-16]，在浓缩和分离过程继续起作用，如图4所示。

图4 下游处理后残糖中各组分质量浓度Fig.4 The content of residual sugar components after downstream treatment

3.4 产酸情况

图5为14批次发酵液的产酸，1～8批为未添加海藻糖酶发酵液，9～14批为添加海藻糖酶的发酵液。实验表明：未添加海藻糖酶平均产酸177.3 g/L，添加海藻糖酶后平均产酸为177.7 g/L，几乎无差别，说明添加海藻糖酶对发酵产酸水平影响不大，结果如图5所示。

图5 添加与未添加海藻糖酶在产酸方面的对比Fig.5 Comparison of glutamate production of treatments with or without trehalase addition

3.5 发酵转化率情况

共进行95批次发酵液转化率的统计，其中1～24批和82～95批为未添加海藻糖酶的发酵液，25～81批为添加海藻糖酶的发酵液。从实验数据可知，添加海藻糖酶的罐次平均发酵转化率比未添加海藻糖酶的平均提高0.5%～1%，结果如图6所示。

图6 添加与不添加海藻糖酶对发酵转化率的对比Fig.6 Comparison of sugar-acid conversion between adding trehalase and not adding

4 结 论

通过海藻糖积累曲线可知：在发酵进行至28 h时，海藻糖积累量最高；为降低染菌几率，可在24 h时添加海藻糖酶；加酶后可使海藻糖质量分数降低74%，糖酸转化率提高0.5%～1%；另外，受发酵温度影响，海藻糖酶活性受到限制，故可以通过调节海藻糖酶的添加量达到预期的效果。通过对浓缩发酵液及分离后母液的各残糖组份进行分析可知：海藻糖酶可有效降低残糖质量浓度，从而降低发酵液、分离母液的黏度，为下一步谷氨酸的提取和母液造粒制肥提供有利条件。