基于X射线相衬显微CT的肝组织脱水优化研究

王 坤，张学良，周明璋，宋秋楠，王永治，季学闻，刘慧强

(新疆医科大学1公共卫生学院，2医学工程技术学院，乌鲁木齐 830011； 3新疆医科大学第一附属医院肝胆外科，乌鲁木齐 830054)

动物模型的肝组织非常柔软脆弱，且血管丰富，因此在组织脱水处理中存在欠脱水和过脱水的情况。欠脱水导致组织这种脱水不彻底，组织内含有水分，在X射线成像过程中由于受热或蒸发等因素导致产生形变伪影，欠脱水在制作病理切片时二甲苯无法完全渗入细胞内，将可能导致石蜡无法完全渗入组织内，不能起到支撑作用，将导致切片产生形变；过脱水会导致组织失水过度，在成像样品固定时出现裂纹或破损，切片时出现发脆易碎的现象，因此如何控制好软组织样品脱水全周期的浓度梯度、脱水时间、环境温度等因素是至关重要的[1-2]。目前，X射线相衬显微CT(Synchrotron Radiation-based X-ray phase-contrast Computed Tomography,SR-XPCT)开展软组织病/生理学研究，其脱水方法不尽相同，成像结果与生物结构间存在较大差异，对研究结果的可靠性产生不利影响。本文综合考虑固定液种类、脱水梯度、脱水时间分配等因素，将72个正常C57BL/6小鼠的肝组织样品分为8组进行成像，探讨不同处理方式SR-XPCT成像样品的形态学变化和图像质量，进而为SR-XPCT实验样品前处理提供参考。

1 材料与方法

1.1 样品制备与分组本实验选用健康的清洁级雄性6～8周龄C57BL/6小鼠24只(质量18～22 g，由新疆医科大学动物实验中心提供，实验动物许可证：SYXK(新)-0003)，采用随机数字表法分为8组，每组3只，均按要求分笼饲养于清洁级动物房中，室温约为21℃，按照标准提供饮食、清洁水及按时更换小鼠垫料，适应性饲养1w后采用3%戊巴比妥钠过量麻醉致死，解剖后摘取小鼠肝脏组织(每只取3个样品)，72个正常C57BL/6小鼠肝脏样品随机分为4%多聚甲醛组(P组，亚组P1～P4)和10%中性福尔马林溶液组(F组，亚组F1～F4)，清洗后放入固定液固定18～24 h，蒸馏水冲洗2 h后进行40～100%乙醇梯度脱水，待样品晾干后置于阴凉干燥处保存，留作成像备用。本实验样品已获得新疆医科大学第一附属医院动物伦理委员会批准。

1.2 X线相衬成像及处理本实验于中国科学院上海同步辐射装置(Shanghai Synchrotron Radiation Facility，SSRF) X射线成像与生物医学应用光束线站(BL13W1)采用同轴成像进行实验，将制备好的实验样品牢固的固定在连续旋转的载物台中央进行0°～180°的CT扫描成像，通过X射线探测器采集原始投影图像(Tomo)、背景图像(Flat)及暗场图像(Dark)，成像CCD分辨率为6.5 μm/pixel，见图1。

图1 上海光源BL13W1光束线成像及图像处理流程(标尺：200 μm)

2 结果

2.1 XPCT断层成像处理后肝样品进行XPCT成像断层图像见图2～5。形态学观察结果：F组图像衬度及微血管清晰度整体优于P组，其中F1和P1(F2和P2、F3和P3、F4和P4)相比，F组样品组织结构边缘锐利，清晰度较好，样品与背景区分度较为明显。在F组矢状面断层图像中，F1和F2图像微血管数量和清晰度高于F3和F4，且F2组相比于F1组的组织微血管边缘及形态完整性较高。由矢状面断层血管灰度差可得：F1和P1、F2和P2、F3和P3、F4和P4差异有统计学意义(P<0.05)，在组间比较中，除P1和P2差异无统计学意义(P>0.05)，其余组内各组差异均有统计学意义(P<0.05)，与形态学观察结果一致。

图2 XPCT成像横断面(标尺：200 μm)

图3 XPCT成像矢状面(标尺：200μm)

图4 矢状面断层血管边缘灰度

图5 血管边缘灰度差组间(A)与组内(B、C)比较

肝组织三维血管网络结果显示： P组和F组三维图像血管形态学观察结果与二维类似，相比于P组，F组血管边缘增强，辨识度更高，利于无造影剂的微血管观察和分析，见图6。

2.2 微观结构改变的定量分析一级静脉血管直径进行分析结果显示：P组内除了P1和P2之间差异无统计学意义，其余各组间的差异均有统计学意义(P<0.05)；F组内除了F1和F2、F3和F4差异无统计学意义(P>0.05)，其余组间差异均有统计学意义(P<0.05)。同一脱水梯度下，F组血管直径大于P组，但差异无统计学意义(P>0.05)，见图7。图像ROI区域CNR分析结果显示：F组ROI区域的CNRs优于P组，除P2和F2外，其余组间差异均有统计学意义(P<0.05)。在P组中，P2与其余3组差异均有统计学意义(P<0.05)；在F组中，除F1和F4、F2和F3外，其余组间差异均有统计学意义(P<0.05)，见图8。

图6 肝组织三维重构局部细节图像(标尺：200 μm)

图7 不同组间血管直径定量分析

图8 断层图像ROI区域CNRS比较

3 讨论

生物软组织样品前期处理是SR-XPCT过程中尤为重要的一步，其处理结果的优劣将会直接影响该样品的成像效果，进而对实验数据的处理和分析带来无法逆转的干扰。组织固定、脱水是生物样品进行SR-XPCT和病理、生理切片观察常用的前处理方法，合理的选择固定液、脱水浓度及时间分配将有助于提高SR-XPCT的精度及切片的完整度，便于后期形态学观察及数据分析。

甲醛作为常用的固定剂，由于其渗透力强，固定均匀，对组织收缩少，对脂肪、神经及髓鞘、糖等固定效果较好，因此使用较为普遍。但是经甲醛长时间固定的组织，易产生黑色沉淀，且不利于染色，尤其是细胞核。因此实验固定液均采用新配制的10%中性福尔马林和4%多聚甲醛，这样的固定液在固定细嫩的软组织时缓慢渗透，作用温和，不会产生强烈的收缩，最大限度保持了组织原有结构，便于后期包埋及切片后染色处理。乙醇是最常用的脱水剂，可与蒸馏水随意混合，脱水时穿透能力较强，穿透速度很快，但对组织有较为明显的收缩作用。因此在动物脆弱的肝组织的脱水过程中，乙醇的浓度梯度是极为重要的影响因素，脱水过度和脱水不足均影响成像结果及切片质量，一般使用脱水浓度由70%开始，但对于柔嫩脆弱样品组织，必须降低起始浓度[1]。

SR-XPCT作为一种新型高精度和高分辨率成像技术已成为该领域的研究热点[8]，其通过探测X射线在不同密度组织中的相位变化差异进行无损成像[9-10]，相比于X射线透视、超声和MRI等传统成像方式的低空间分辨率和衬度，以及病理切片对样品完整度具有特有的优势[11-12]。基于高空间分辨率和时间分辨率的成像特点，国内外开展了一些SR-XPCT研究，尤其在脑、肺、肝、肾、皮肤、血管和动物软骨等弱吸收器官和组织的相关疾病模型中较为广泛，对疾病早期病因检测、病因分析及发展趋势预测具有独特的优势。

本研究结果表明，在8组C57BL/6小鼠肝脏组织断层血管边缘灰度变化中，F1和P1、F2和P2、F3和P3、F4和P4之间结果表明不同固定液对样品血管边缘的影响存在差异，同时在肝一级静脉血管直径中，F1和P1、F2和P2、F3和P3、F4和P4差异无统计学意义，这也说明中性缓冲液的对血管形态的固定作用无影响，但对组织免疫组化反应可能产生影响[13]。P组和F组之间血管形态效果及切片清晰度较好的为P2和F2，表明40%的低起始浓度及梯度缓慢变化至100%对血管网的重构效果最好。在组织密度分辨率中，F组中ROI区域的CNR高于P组，其中CNR最高的为F2，表明采用F2组处理方式成像的衬度及清晰度较高，对观察生物组织浸润、侵害等微观病变的早期检测具有独特的优势。

综上，10%中性福尔马林固定、乙醇脱水梯度浓度由40%缓慢过渡到100%时，处理的组织成像效果最好。此外，由于软组织间的生理功能的差异，针对不同的实验样品和实验目的，还需恰当的选择样品固定液、脱水梯度和样品处理温度及时间，调整其参数以获得高质量的图像数据，对后期三维重构的精确度和图像分析提供高精度和准确度的数据支持，避免引起结果误差，甚至出现假阴性或假阳性而造成的错误结论。

(致谢 感谢上海光源BL13W1线站的工作人员在XPCT实验中给予的热心帮助和悉心指导。)