LncRNA-SNHG17通过调控miR-23b-3p促进非小细胞肺癌进展

哈依努尔，戴月梅，木叶沙尔·皮达义，迪丽努尔·吾甫尔，陈 林

(1中南大学湘雅医院卫生部肿瘤蛋白组学重点实验室，长沙 410008； 2新疆医科大学第一附属医院呼吸与呼吸危重症中心一病区，乌鲁木齐 830054)

近几十年来，肺癌的发病率和死亡率都明显增高，是世界范围内的主要人口死亡原因。非小细胞肺癌(NSCLC)约占所有肺癌的85%，是最常见的肺癌类型[1]。虽然近些年在肺癌诊断方法、手术技术、新的化疗方案等方面取得了很大的进展，但NSCLC患者的5年生存率仍然较低[2-3]。因此，研究NSCLC发展过程中肿瘤发生的分子机制，寻找新的有效治疗靶点，对于提高患者生存率至关重要。长链非编码RNA (long noncoding RNAs,lncRNAs)是一类新发现的长度超过200个核苷酸的非蛋白编码转录本，其参与细胞发育、凋亡、分化以及免疫应答[4-5]等多种生理病理过程。越来越多的证据表明，LncRNA的失调在各种类型的癌症的发生和进展中起着关键作用[6-8]。对于非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)，许多LncRNA已被证实参与了NSCLC的发生和发展，并可作为NSCLC诊断或治疗靶点[9-10]。SNHG17(小核仁RNA宿主基因17)已被证实在胃癌、结直肠癌的发生、发展和转移方面发挥重要作用[11-13]。然而，目前尚不清楚SNHG17在人类非小细胞肺癌中是否存在异常表达，或与功能调控有关。微小RNA (miRNA) 是一类长度约为22 个核苷酸的非编码单链RNA分子，研究证实,miRNA与肺癌等多种肿瘤的发生发展密切相关[14-16],而LncRNAs可以作为一种内源竞争RNA (ceRNA)作用于特定的miRNAs，导致相应的miRNA靶向转录。本研究发现SNHG17在非小细胞肺癌细胞系中具有高表达，SNHG17与miR-23b-3p关系密切，LncRNA-SNHG17可能是miR-23b-3p的内源竞争RNA，通过调控miR-23b-3p促进非小细胞肺癌进展,现将结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 细胞系NSCLC细胞株(H358、A549、SK-MES-1、H1299)和正常人支气管上皮细胞16HBE均购自ATCC(American Type Culture Collection)。细胞培养于RPMI-1640培养基(Thermo Fisher scientific,MA,USA)，含10%胎牛血清(Thermo Fisher scientific,MA,USA)，37℃，5% CO2湿化空气。

1.2 细胞转染pLCDH-ciR-SNHG17质粒和SNHG17-SiRNA序列分别由上海吉玛公司构建与合成。用Lipofectamin 2000脂质体转染试剂盒转染pLCDH-ciR-SNHG17质粒或siRNA到细胞中，分别设阴性对照组。设计的siRNA序列如下：siRNA-NC:(5′-UUGUAAUACACCAAAGUACUG-3′),SNHG17-siRNA：(5′-GGUGGACCAUGGUGUUCUATT-3′)。

1.3 qRT-PCR实验使用TRIzol试剂盒(Thermo Fisher scientific,MA,USA)从细胞中提取RNA。采用EX TaqTMII试剂盒(TaKaRa,Shiga,Japan)进行SNHG17水平检测。内部对照为GAPDH和U6。引物序列如下:SNHG17-F:TGCTTGTAAGGCAGGGTCTC; SNHG17-R: ACAGCCACTGA-AAGCATGTG; GAPDH-F: GCTCTCTGCTCCT-CCTGTTC; GAPDH-R:ACGACCAAATCCGTTGACTC.MiR-23b-3p-F:ACACTCCAGCTGGGAT-CACATTGCCAGGGAT; miR-23b-3p-R: CTCA-ACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTG-AGGTGGTAAT; U6-F: CTCGCTTCGGCAGC-ACA; U6-R: AACGCTTCACGAATTTGCGT。

1.4 CCK-8实验采用CCK-8法检测细胞增殖。转染后将5×103个肺癌细胞株A549接种到96孔板中。分别于24、48、72 h用CCK-8试剂(Beyotime,Shanghai,China)在暗箱中孵育2 h，最后用Benchmark PlusTM微板光谱仪(Bio-RadLaboratories Inc)测定各孔在450 nm处的吸光度。

1.5 流式细胞术收集转染后的A549细胞，用70%冷乙醇4℃固定。固定后的细胞用PBS洗2次,并用10 μg/mL RNase A 和20 μg/mL PI(Sigma-Aldrich) 37℃下孵育30 min。细胞周期分布采用流式细胞分析仪分析(BeckmanBiosciences，USA)。采用MODFIT LT软件(BD Biosciences)分析G0/G1期、S期和G2/M期细胞的百分率。

1.6 Transwell实验在无血清培养基中，约2×104个A549细胞被接种到无涂层或涂有基质凝胶的小室上层，底层加入750 μL培养液。培养24 h后取出上层细胞，用4%多聚甲醛固定下层细胞，0.1%结晶紫染色。用光学显微镜对迁移和侵袭细胞数进行计数。

2 结果

2.1 SNHG17在NSCLC细胞系中表达上调包括H358、SK-MES-1、H1299、A549在内的非小细胞肺癌细胞系SNHG17表达水平明显高于正常人类非小细胞肺癌上皮细胞系16HBE(图1)。A549细胞株表达的SNHG17最高。

2.2 SNHG17的沉默抑制非小细胞肺癌细胞增殖和迁移通过转染siRNA，SNHG17在A549细胞中沉默(与siRNA-NC比较，P<0.01，图2a)。然后进行细胞计数(CCK8实验)，发现沉默SNHG17显著降低了A549细胞的增殖能力(图2b)。流式细胞术结果表明，SNHG17基因敲除后，A549细胞中G1期细胞比例增加，S期细胞和G2M期细胞比例下降(P<0.05，图2c、2d)。采用Transwell法测定SNHG17基因敲除后的细胞迁移能力,结果表明，SNHG17siRNA显著减少了细胞的迁移(图2e、图2f)。这些结果提示SNHG17调控非小细胞肺癌细胞的增殖和迁移。

图1 SNHG17在非小细胞肺癌中的表达

注： 与正常支气管上皮细胞16HBE比较，*P<0.01。

图2 SNHG17沉默抑制非小细胞肺癌细胞增殖和迁移

a: qRT-PCR结果显示，转染SNHF17干扰RNA后，A549细胞株SNHG17表达下调; b: CCK8实验表明，转染不同时间，SNHG17可不同程度抑制非小细胞肺癌细胞增殖; c、d: 转染si-SNHG17 48 h后用流式细胞术检测A549细胞周期; e、f: Transwell实验表明，SNHG17沉默抑制非小细胞肺癌细胞迁移能力。注：与siRNA-NC比较,*P<0.05。

2.3 SNHG17的上调促进非小细胞肺癌细胞增殖和迁移为进一步验证SNHG17在非小细胞肺癌中的作用，我们通过将pLCDH-SNHG17质粒转染至A549细胞中过表达SNHG17(与pLCDH比较，P<0.01，图3a)。CCK8实验和流式细胞术细胞周期实验均显示，SNHG17过表达促进了A549细胞的生长(图3b～3d)。此外，Transwell检测表明，pLCDH-SNHG17的转染促进了A549细胞的迁移(P<0.01 vs.pLCDH，图3e、3f)。这些数据进一步证明了SNHG17在非小细胞肺癌中的致癌作用。

图3 SNHG17上调促进非小细胞肺癌细胞增殖和迁移

a: qRT-PCR结果显示，转染pcDNA-SNHG17质粒后，SNHG17表达水平升高; b: CCK8实验表明，SNHG17过表达促进非小细胞肺癌细胞增殖; c、d: 用流式细胞术检测转染SNHG17质粒的A549细胞的细胞周期; e、f: Transwell实验表明，SNHG17转染增强非小细胞肺癌细胞迁移侵袭能力,注： 与pLCDH比较,*P<0.05。

2.4 SNHG17可能是miR-23b-3p的内源竞争RNA使用软件Starbase v2.0预测与SNHG17相互作用的miRNA，发现miR-23b-3p可以与SNHG17中的互补序列结合(图4a)。我们用qRT-PCR分析发现，包括H358、SK-MES-1、H1299、A549在内的非小细胞肺癌细胞系，miR-23b-3p水平明显低于正常人支气管上皮细胞系16HBE(图4b)，沉默SNHG17导致A549细胞中miR-23b-3p表达水平升高(图4c),在A549细胞中过表达miR-23b-3p抑制了SNHG17的表达(图4d)，说明SNHG17与miR-23b-3p关系密切。

3 讨论

以往的研究发现，人类基因组序列约98%被转录成非编码RNAs(lncRNAs)，其中长度为>200 nt的长非辅酶核糖核酸(lncRNAs)越来越受到关注[7-8]。越来越多的证据表明，lncRNAs在多种癌症的发病机制中起主要作用[7-8,17]。小核仁RNA宿主基因(SNHG)在非小细胞肺癌中表达上调。相关研究报道，SNHG1通过抑制miR-101-3p和激活Wnt/β-catenin 信号通路促进非小细胞肺癌进展；SNHG7通过调节FAIM2表达来抑制肺癌细胞凋亡[17-18]。许多研究发现，沉默SNHG16可以抑制多种肿瘤瘤体的生长[19-20]。SNHG17也是SNHG的重要成员之一，但其在非小细胞肺癌中的表达和作用尚不清楚。

图4 SNHG17可能是miR-23b-3p的竞争内源性RNA

a: 用软件Starbase v2.0预测SNHG17与 miR-23b-3p相互作用位点; b: qRT-PCR结果显示,miR-23b-3p在非小细胞肺癌细胞系中表达水平低于正常人支气管上皮细胞系16HBE，注: 与16HBE细胞系比较，*P<0.05; c: qRT-PCR结果显示，沉默SNHG17可使A549 细胞miR-23b-3p表达水平比siRNA-NC组增高，注: 与siRNA-NC组比较,*P<0.05; d: qRT-PCR结果显示，在A549细胞中过表达miR-23b-3p，SNHG17表达水平低于对照组，注: 与NC mimic组比较,*P<0.05。

本研究结果显示，SNHG17在非小细胞肺癌细胞系中高表达，提示SNHG17可能是一种预后生物标志物。此外，我们还通过CCK8、Transwell等一系列实验证实了SNHG17对A549细胞的恶性行为具有促进作用。研究结果揭示了SNHG17是NSCLC的致癌因子。然而，SNHG17是否调控NSCLC尚需深入研究。

lncRNA-miRNA-mRNA调控方式已得到普遍认可。lncRNA可作为microRNA的ceRNA促进信使RNA的表达[21]。因此，我们对SNHG17中能够结合互补序列的miRNA进行了分析。miR-23b-3p在3′-UTR上具有互补的结合位点,有报道称miR-23b-3p通过调节长链非编码RNA MALAT1调控胃癌[22]，在肾癌中抑制PTEN基因表达[23]，通过ATG12和HMGB2调控胃癌细胞的耐药性[24]。另一项研究通过整合microRNA表达谱和基因组分析发现miR -23b-3p在非小细胞肺癌组织中下调[25]。但miR-23b-3p在非小细胞肺癌中的生物学作用尚不清楚。我们还发现SNHG17抑制 miR-23b-3p的表达，在非小细胞肺癌中可能是miR-23b-3p的内源竞争RNA(ceRNA)。

综上所述，lncRNA-SNHG17通过竞争性结合miR-23b-3p促进NSCLC的发生。通过我们的研究，对SNHG17在非小细胞肺癌中的作用有了更好的了解，对以后研究lncRNA相关的NSCLC诊断及治疗有了促进作用。