银灵康胶囊的提取工艺研究

1.长春医学高等专科学校，吉林 长春 130031；2.绿叶集团北大维信生物制药公司，辽宁 沈阳 110016

银屑病是一种常见的红斑鳞屑性皮肤病,俗称“牛皮癣”,相当于中医学中的“白”,其缠绵难愈、易于复发。西医学认为,其发病与遗传、感染、代谢障碍、内分泌失调、神经精神因素及免疫紊乱等多方面因素有关，目前尚无理想疗法。中医药治疗此病疗效确定，且具有延长缓解期、副作用小的特点[1]。银灵康胶囊在治疗银屑病方面有着显著的疗效。银灵康胶囊由金银花、土茯苓、青黛、白鲜皮、牡丹皮、生石膏六味药材组成的中药复方，具有清热解毒、凉血、滋阴润燥、养血祛风之功效[2]。主治寻常型银屑病，以及愈后的预防和巩固治疗。本方中金银花和土茯苓均具有杀菌、抗炎、提高免疫力的作用。本实验参照中药、天然药物制剂研究的技术指导原则，优化金银花和土茯苓的提取工艺。采用单因素法，以绿原酸和落新妇苷含量为指标，考察提取溶剂种类、提取方法、提取次数等因素对提取效率的影响。设计正交试验，以绿原酸和落新妇苷含量作为综合评分指标，确定最佳提取工艺。为研究疗效更确切，质量稳定的银灵康胶囊奠定基础。

1 仪器与材料

1.1 仪器 JASCO高效液相色谱仪(日本分光公司)；UV-2075型紫外可见光检测器(日本分光公司)；Sepu3000色谱工作站(山东金普分析仪器有限公司)；AT-130柱温箱(上海理达仪器厂)；BS110S型电子天平(德国Sartorius公司)；PHS-3BW精密数显酸度计(上海理达仪器厂)；KH-250DE型数控超声波清洗器(昆山禾创超声仪器有限公司)；JP-A型架盘天平(上海一恒科学仪器有限公司)；恒温水浴锅HH-Z(国华电器有限公司)；真空干燥箱(上海一恒科学仪器有限公司)。

1.2 材料 绿原酸对照品(批号：1110753-200413)、落新妇苷对照品(批号：111798-201102)购于中国药品生物制品检定所，甲醇(批号：20180525)、无水乙醇(批号：20180418)、丙酮(批号：20180306)都为分析纯，购于山东禹王实业有限公司化工分公司，乙腈为色谱纯(批号：20180-309)购于山东禹王实业有限公司化工分公司，微晶纤维素(批号：171104A郑州浩力化工有限公司)、重蒸水(自制)。

金银花、土茯苓、白鲜皮、牡丹皮、青黛等药材均购自安国市神禾中药材饮片有限责任公司，经辽宁中医药大学李少宁副教授鉴定，符合2015年版《中国药典》药材项下规定。

2 方法与结果

2.1 绿原酸和落新妇苷含量测定

2.1.1 溶液的制备

2.1.1.1 混合对照品储备液 取绿原酸、落新妇苷对照品适量，精密称定，分别置于25 mL棕色量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制成质量浓度分别为2.40 mg/mL和0.110 mg/mL的对照品储备液。精密量取绿原酸对照品储备液2 mL、落新妇苷对照品储备液2.5 mL，置于同一50 mL棕色量瓶中，用体积分数50%甲醇水溶液稀释至刻度，摇匀，即得到混合对照品储备液。

2.1.1.2 供试品溶液 取样品干浸膏约2.0 g，精密称定，研细，置具塞锥形瓶中，精密加入无水乙醇50 mL，密塞，称定质量，超声处理(功率220 W，频率50 Hz)30 min，放冷，再称定质量，用无水乙醇补足减失的质量，摇匀，滤过；精密量取续滤液2 mL，置10 mL棕色量瓶中，加体积分数50%甲醇水溶液至刻度，摇匀，用微孔滤膜(0.45 μm)滤过，取续滤液，即得。

2.1.1.3 阴性对照溶 液按处方比例制备除金银花、土茯苓外的阴性样品，按“2.2.1.2”项下方法制备阴性对照溶液。

2.1.2 色谱条件 色谱柱：Kromasil C18柱(150 mm × 4.6 mm，3.5 μm)；流动相：乙腈 (A)-体积分数0.05%磷酸溶液(B)；梯度洗脱，程序见表1；柱温：30 ℃；检测波长：291 nm；流速1.0 mL/min；进样量：20 μL。

表1 梯度洗脱

2.1.3 系统适用性试验 取供试品溶液，在上述色谱条件下进样，理论塔板数按绿原酸峰计算不低于 5000。供试溶液中绿原酸、落新妇苷与相邻色谱峰的分离度均大于1.5，阴性对照对测定无干扰。色谱图如图1所示。

2.1.4 线性关系考察 精密量取混合对照储备液1.0、2.0、4.0、6.0、8.0 mL，分别置10 mL棕色量瓶中，用体积分数50%甲醇水溶液稀释至刻度，摇匀，即得系列对照溶液。在上述色谱条件下进样，记录峰面积。以质量浓度(ρμg/mL)为横坐标，以峰面积(A)为纵坐标，进行线性回归。绿原酸、落新妇苷回归方程分别为A=2.961×104ρ-2.375×104，(r=0.999 9)和A=6.757×104ρ+1.423×103(r=0.999 5)。结果表明，绿原酸、落新妇苷质量浓度分别在9.60～96.0 μg·mL-1和0.55～5.50 μg/mL内与峰面积呈良好的线性关系。

2.1.5 精密度试验 取混合对照溶液(绿原酸、落新妇苷的质量浓度分别为38.4、2.20 μg/mL)，在上述色谱条件下重复进样6次，计算绿原酸、落新妇苷峰面积的RSD分别为1.4%、2.2%。表明仪器精密度良好。

2.1.6 重复性试验 精密称取同一批样品6份，按“2.2.1.2”项方法制备供试溶液，在上述色谱条件下分析，以外标法计算绿原酸、落新妇苷含量的RSD分别为2.0%(n=6)、2.6%(n=6)。表明方法重复性良好。

2.1.7 稳定性试验 取“2.2.6”项下重复性试验的同一供试溶液，室温放置。在上述色谱条件下，分别在0、2、4、6、8、10、12 h进样分析。计算绿原酸、落新妇苷峰面积的RSD分别为2.5%、2.1%。表明供试品溶液室温放置至少在12 h内稳定。

2.1.8 回收率试验 精密称取已测定含量的样品约1.0 g，共9份。分别精密加入质量浓度为2.40 mg/mL绿原酸对照储备液1、2、3 mL，质量浓度为0.110 mg/mL落新妇苷对照储备液1.6、3.3、4.8 mL(制备低、中、高3个质量浓度的样品，n=3)，按“2.2.1.2”项下方法制备供试溶液，在上述色谱条件下进样分析，计算回收率，结果见表2。

表2 银灵康胶囊中绿原酸和落新妇苷回收率试验结果 (n=9)

2.2 单因素试验

2.2.1 考察因素

2.2.1.1 提取溶剂考察 绿原酸是一种极性较强的分子，落新妇苷是一种中等极性的分子，都易溶于醇和丙酮，所以本实验考察了不同浓度的乙醇，甲醇，丙酮和水作为提取溶剂对绿原酸和落新妇苷提取效果的影响。

2.2.1.2 提取温度考察 在预实验及相关文献基础上[3]，提取过程中温度过低，不利于绿原酸的溶出；温度过高，又易引起绿原酸的降解。故本实验在50～90℃范围内研究温度对提取的影响。考察的温度分别为50、60、70、80、90℃，料液比为1∶10，提取时间2 h，提取2次，用90%乙醇进行回流提取。

2.2.1.3 提取时间考察 根据预实验及相关文献[4-5]适当的延长提取时间，能够提高绿原酸和落新妇苷的得率，但是如果提取时间过长，不但不能提高绿原酸和落新妇苷的得率，反而会使样品降解，增加提取液中杂质的含量。所以本实验在料液比为1∶10，提取温度为80℃，提取次数2次前提下，采用0.5、1、1.5、2、2.5、3 h为提取时间，用90%的乙醇回流提取。

2.2.1.4 料液比考察 一般来说，溶剂过少，溶液容易饱和，其有效成分不能提取完全；溶剂过多，虽然提取较完全，但是给下一步浓缩操作带来不便，而且浪费能源。本实验在上述实验确定提取温度80℃，提取时间2 h前提下，分别以1∶6、1∶8、1∶10、1∶12、1∶15、1∶20的料液比进行考察。

2.2.1.5 提取次数考察 在上述实验确定了提取时间2 h，提取温度80℃，料液比1∶10的基础上，对样品不同提取次数(1、2、3、4 次)进行考察。

2.2.1.6 浸泡时间考察 按单因素分析所得出的优化条件(即乙醇浓度90%,提取时间2 h,温度80℃，提取次数2次)分别考察浸泡0.5、1、1.5、2 h对样品提取率的影响。

2.2.2 提取溶剂选择 参考文献报道[6-7]，实验考察80%乙醇、80%甲醇、80%丙酮和水对提取效率的影响。从图2可知，用80%乙醇和80%甲醇提取时绿原酸的得率差别不大；落新妇苷的得率在80%乙醇中是最高的，且乙醇的毒性小于甲醇的毒性。故本实验选择乙醇为提取溶剂。

2.2.3 乙醇比例的选择 乙醇浓度对银灵康胶囊中绿原酸和落新妇苷提取效率的影响。从图3可知，随着乙醇浓度的增加，绿原酸得率增加，且在乙醇浓度90%时最高，然后降低；落新妇苷得率在乙醇浓度95%时最高。综合分析，因此，本实验最终选择90%乙醇作为提取溶剂。

2.2.4 提取温度选择 实验考察了不同提取温度对银灵康胶囊中绿原酸和落新妇苷提取效率的影响。从图4 可知，随着温度增加，绿原酸含量在80 ℃时达到峰值，之后随着温度增加而下降；落新妇苷含量也在温度80 ℃时最高值，之后迅速下降。因此，将本实验的提取温度定为80 ℃。

2.2.5 提取时间选择 考察不同提取时间对银灵康胶囊中绿原酸和落新妇苷提取效率的影响。从图5可知，随着提取时间增加，绿原酸得率缓慢增加，在提取时间为2 h时达到峰值，然后又缓慢下降；落新妇苷得率在提取时间为2 h时最高值，而后下降至平缓。因此，本实验采用提取时间为2 h。

2.2.6 料液比选择 考察不同的料液比对银灵康胶囊中绿原酸和落新妇苷提取效率的影响。从图6可知，随着料液比增加，绿原酸得率也有所增加，但是幅度不大，在1∶15时出现一个峰值，然后略有下降；落新妇苷得率在1∶10时出现峰值，之后下降趋于平稳。因此，本实验选择料液比为1∶10。

2.2.7 提取次数选择 考察不同的提取次数对银灵康胶囊中绿原酸和落新妇苷提取效率的影响。从图7可知，绿原酸得率在提取次数为2次时达到峰值，之后随着提取次数的增加，绿原酸得率下降；落新妇苷得率同样在提取次数为2次时最高，之后迅速下降。综上分析，本实验选择提取次数为2次。

2.2.8 浸泡时间选择 考察不同的浸泡时间对银灵康胶囊中绿原酸和落新妇苷提取效率的影响。从图8可知，浸泡1.5h时，绿原酸和落新妇苷得率最高。因此，选择浸泡时间为1.5h。

2.2.9 提取方法选择 对超声法和回流法进行比较，从图9可知，回流法的提取效率高于超声法提取效率。故本实验选择回流法提取。

2.3 正交试验

2.3.1 样品提取物的制备 按处方比例称取金银花、土茯苓、白鲜皮、牡丹皮药材适量，采用乙醇回流提取，提取液过滤，置于干燥至恒重的蒸发皿中，浓缩至相对密度为1.25～1.28(80℃)的稠膏，加入生石膏、青黛粉，充分混匀，60 ℃下减压干燥(24 h)，得到初提物。以不同提取溶剂，不同提取次数，不同提取时间，不同料液比，不同浸泡时间，不同乙醇浓度，温度，不同提取方法(超声或回流)进行单因素试验，然后以单因素试验结果设计四因素三水平的正交试验，对银灵康胶囊中的金银花和土茯苓提取工艺进行优化。

2.3.2 因素水平设计 为了进一步优化银灵康胶囊提取工艺，根据以上单因素实验结果并参考文献，本实验选取对银灵康胶囊中绿原酸和落新妇苷提取率影响较大的4个因素：提取时间(A，1.5、2、2.5 h)，提取次数(B，1、2、3次)，提取溶剂(C，85%乙醇、90%乙醇、95%乙醇)，料液比(D，1∶8、1∶10、1∶12)，进行L9(34)正交试验。以获得这些因素对绿原酸和落新妇苷提取率影响的变化趋势,并考察各因素对提取率影响的主次顺序。因素水平见表3，正交试验安排见表4。

表3 因素水平设计方案

表4 正交试验安排

续表4

表4 正交试验安排

2.3.3 试验结果 采用综合评分法[8]，以绿原酸的权重系数为0.6，落新妇苷的权重系数为0.4进行综合评分。综合评分分数=(绿原酸/绿原酸最大值×绿原酸的权重系数+落新妇苷/落新妇苷最大值×落新妇苷的权重系数)×100。其中绿原酸/绿原酸最大值表示每一实验测得的绿原酸含量与9次测定的最高含量比值；落新妇苷/落新妇苷表示最大值每一实验测得的落新妇苷含量与9次测定的最高含量比值。正交试验结果见表5，方差分析结果见表6。

表5 正交试验结果

表6 方差分析结果

从直观分析可知，各因素对绿原酸和落新妇苷提取率的影响顺序为：A>B>D>C。以极差最小的C因素为误差，进行方差分析可知，A，B，D因素对提取率都有显著影响，仅C因素对提取率无显著影响。因素A有显著性差异，且A2>A3>A1，故选择A2；因素B有显著性差异，且B3>B2>B1，应该选择B3，但从极差的均值看水平B2和B3相接近，从节省时间的角度考虑，选择B2；因素D也有显著性差异，且D1>D2>D3，故选择D1。C无显著性差异，且C2>C1>C3，结合单因素试验，选择C2。最后确定最佳工艺为：A2B2C2D1，即以10倍量85%乙醇，水浴回流提取2次，提取时间为2 h。

2.3.4 验证实验 按处方比例称取各药材3份，以最终确定的提取工艺A2B2C2D1，进行验证，按照“2.1”项下方法测定绿原酸和落新妇苷的含量，取平均值测得绿原酸的提取率为12.4 mg/g，落新妇苷的提取率为0.686 mg/g，该方法重现性好，故认为该工艺稳定可靠。验证结果见表7。

表7 验证结果

3 讨论

3.1 指标性成分的选择 银灵康胶囊由金银花﹑土茯苓﹑青黛﹑白鲜皮、牡丹皮、生石膏6味药材组成。金银花为方中君药，药典中金银花含量测定的指标性成分为绿原酸和木犀草苷；另一君药土茯苓中的指标性成分为落新妇苷；青黛为臣药，指标性成分为靛蓝和靛玉红；白鲜皮和牡丹皮为佐药，指标性成分分别为梣酮、黄柏酮和丹皮酚。在制备工艺中，青黛和生石膏是不经提取加入的，不必考察其指标性成分的提取效率；金银花中木犀草苷、白鲜皮中梣酮和黄柏酮含量偏低，而牡丹皮中的丹皮酚又难于测到。因此，本实验选择绿原酸和落新妇苷为指标性成分，优化了提取工艺。

3.2 权重系数的选择 现代研究证明，绿原酸具有清除自由基、抗诱变抗癌、降脂、抗炎和免疫调节等作用；落新妇苷则具有抗炎、免疫，抑制利尿和镇痛等作用。由于银屑病是一种与免疫相关的疾病，对免疫系统有调节作用的化合物均与治疗相关，有助于缓解症状。虽然绿原酸和落新妇苷都与治疗相关，但各自所起得作用并非完全一样，绿原酸主要以抗炎为主，落新妇苷抗炎和免疫调节作用相当。根据预实验可知，绿原酸的含量较高，而落新妇苷的含量较低，为了更加体现其他有效成分作用并结合相关文献报道[9]，绿原酸的权重系数为0.6，落新妇苷的权重系数为0.4。以2种指标成分确定最佳提取工艺可以为后续试验提供依据。

3.3 提取工艺的选择 实验中以银灵康胶囊中绿原酸和落新妇苷的含量为指标进行工艺评价，根据单因素考察和正交试验确定了银灵康胶囊的提取工艺：金银花、土茯苓等按处方配比称取药材(除生石膏、青黛外)，以10倍量85%乙醇为溶剂，水浴回流提取2次，提取时间为2 h，合并2次滤液，滤液浓缩至相对密度为1.25～1.28(80 ℃)的稠膏。加入生石膏、青黛粉。60 ℃下减压干燥(24 h)，得到初提物。将初提物粉碎，得到干浸膏粉末。将干浸膏粉和微晶纤维素按比例(干浸膏∶微晶纤维素=20∶1(w/w))混匀，装1号胶囊，即得。规格：0.5 g/粒。通过工艺验证，证明使用优化的提取工艺，绿原酸和落新妇苷的提取效率大大提高。适合实际生产，可作为后续研究的基础和参考。