HPLC法测定安神补心片中6种成分含量

刘莉，李婷婷 ，何君怡

(1.成都市食品药品检验研究院，成都 610045；2.同济大学附属杨浦医院，上海 200090)

安神补心片处方来源于国家药品监督管理局颁药品标准，标准号为WS-11407(ZD-1407)-2002[1]。主要由丹参、石菖蒲、五味子(蒸)、首乌藤、墨旱莲、合欢皮、菟丝子、女贞子、地黄、珍珠母共10味中药组成。临床用于治疗心血不足、虚火内扰所致的心悸失眠、头晕耳鸣。方中丹参具活血通经、清心除烦、养血安神等功效[2-3]，其中丹参酮ⅡA、丹酚酸B为丹参中主要有效成分[4-5]；五味子具镇静安神、收敛固涩、益气生津、宁心安神的功效，主治心神失养之虚烦心悸、失眠多梦等症状[6-8]，五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素为五味子主要有效成分[9-11]；首乌藤具有安五脏、和心志、养血、祛风、止痛、镇静、催眠等作用，可调和阴阳而促进入睡，用于失眠多梦、血虚身痛等[12-14]，2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷为2015年版《中华人民共和国药典》规定首乌藤中指标性成分。原局颁标准仅对处方中丹参酮ⅡA进行含量测定。近年来，相关含量测定方法已有很多报道[15-17]，但同时测定6个成分的方法笔者尚未见报道。本实验参考上述参考文献，经多次摸索实验条件，建立了同时测定安神补心片中丹参酮ⅡA、丹酚酸B、五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素、2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷的高效液相色谱(HPLC)法。该方法准确、简便，灵敏度高，为安神补心片质量标准的完善提供依据，对其质量控制具有重要意义。

1 仪器与试药

1.1仪器 Agilent1200高效液相色谱仪(包括G1311A四元泵，G1329A自动进样器，G1316A柱温箱，G1315D DAD二极管阵列检测器，美国安捷伦公司)；AE-240电子天平(德国赛多利斯公司，感量：0.01 mg)；AEG220电子天平(日本岛津公司，感量：0.1 mg)；SK250H超声仪(上海科导超声仪器有限公司)；Millipore-Q Gradient 超纯水装置(美国密理博公司)。

1.2试药 丹参酮ⅡA对照品(批号：110766-201721，含量：99.5%)、丹酚酸B对照品(批号：111562-201716，含量：94.1%)、五味子醇甲对照品(批号：110857-201714，含量：99.9%)、五味子甲素对照品(批号：111764-201714，含量：99.3%)、五味子乙素对照品(批号：110765-200710)、2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷对照品(批号：110844-201512，含量：91.0%)，均由中国食品药品检定研究院提供；安神补心片(糖衣片，太极集团四川绵阳制药有限公司，批号：1711004)、安神补心片(薄膜衣片，太极集团四川绵阳制药有限公司，批号：1710004，1712005)、安神补心片(太极集团浙江东方制药有限公司，批号：17080012)、安神补心片(比智高药业有限公司，批号：170501)；乙腈为色谱纯，水为Millipore装置制备的超纯水；其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1色谱条件 色谱柱：Sunfire C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：A相为乙腈，B相为0.2%磷酸，梯度洗脱程序见表1；进样量5 μL；紫外检测波长210，270和320 nm；柱温35 ℃。

表1 流动相梯度洗脱程序

2.2溶液的制备

2.2.1对照品溶液的制备 取丹参酮ⅡA、丹酚酸B、五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素、2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷对照品，精密称定，置于25 mL量瓶中，加75%甲醇制成每毫升含丹参酮ⅡA 0.249 5 mg、丹酚酸B 0.762 2 mg、五味子醇甲0.277 7 mg、五味子甲素0.202 6 mg、五味子乙素0.247 6 mg、2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷 0.197 6 mg溶液，作为对照品储备溶液。分别精密吸取上述对照品溶液适量，稀释成不同浓度系列混合对照品溶液。

2.2.2供试品溶液的制备 取质量差异项下本品，研匀，取1.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入75%甲醇50 mL，密塞，称定质量，超声处理30 min，放冷，再称定质量，用75%甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，弃去初滤液，即得。

2.3系统适应性实验 按照“2.1”项色谱条件，取对照品溶液和供试品溶液进样测定，记录色谱图，见图1。在选定的色谱条件下，6种成分的理论板数均不低于200 000，色谱峰与相邻峰的分离度均>1.5。

2.4线性关系考察 精密吸取不同浓度系列混合对照品溶液，分别依次进样，测定色谱峰面积，以对照品进样量为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。结果见表2。

2.5精密度实验 精密吸取同一浓度混合对照溶液5 μL，重复进样6次，测定其峰面积，结果丹参酮ⅡA、丹酚酸B、五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素、2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷的RSD分别为0.51%，0.59%，0.79%，0.56%，0.62%，0.56%。

2.6稳定性实验 精密吸取同一安神补心片供试品溶液(批号：1710004)5 μL，分别于1，2，4，8，12，18，24 h进样，测定其峰面积。结果丹参酮ⅡA、丹酚酸B、五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素、2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷的RSD分别为2.05%，1.82%，2.42%，2.05%，2.35%，1.27%。表明溶液在24 h内基本稳定。

2.7重复性实验 精密称取安神补心片(批号：1710004)6份，按“2.2”项下样品的制备处理样品，按上述色谱条件，测定峰面积。结果样品中丹参酮ⅡA、丹酚酸B、五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素、2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷的RSD分别为1.48%，1.22%，2.35%，2.17%，2.10%，1.45%。

A.混合对照品(210 nm)；B.混合对照品(270 nm)；C.混合对照品(320 nm)；D.供试品 (210 nm)；E.供试品 (270 nm)；F.供试品 (320 nm)；1.五味子醇甲；2.五味子甲素；3.五味子乙素；4.丹酚酸B；5.丹参酮ⅡA；6.2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷。

表2 6种有效成分回归方程、相关系数和线性范围

2.8回收率实验 精密称取已知含量安神补心片(批号：1710004)0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，按1：1比例精密添加丹参酮ⅡA、丹酚酸B、五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素、2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷对照品适量，按供试品制备方法处理，进样5 μL，测定。结果表明丹参酮ⅡA、丹酚酸B、五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素、2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷的回收率(n=6)分别为98.05%(RSD=1.14%)，99.25%(RSD=1.35%)，98.14%(RSD=1.89%)，97.80%(RSD=2.84%)，96.35%(RSD=2.09%)，99.16%(RSD=1.31%)。

2.9样品的测定 取安神补心片5批，照供试品溶液制备方法处理，测定。按外标法以峰面积计算。测定结果见表3。

表3 每片安神补心片中6种有效成分的含量 mg，n=3

3 讨论

3.1检测波长的确定 通过DAD检测器，在200～400 nm波长范围内进行光谱扫描，可知丹参酮ⅡA在270 nm处有最大吸收、丹酚酸B在240～340 nm波长范围吸收强度相似，故将丹参酮ⅡA、丹酚酸B的检测波长定为270 nm；五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素吸收曲线相似，在210 nm处均有较大吸收值，故将五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素的检测波长定为210 nm；2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷在 320 nm处有最大吸收，故将2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷的检测波长定为320 nm。

3.2流动相的选择 分别以乙腈-0.2%磷酸溶液、甲醇-0.2%磷酸溶液为流动相，分别采用等度洗脱与梯度洗脱，流速均为1.0 mL·min-1，结果表明，等度洗脱不能有效地、高分辨地洗脱出全部对照品组分，特别是丹参酮ⅡA与五味乙素分离不好。而甲醇作为流动相在210 nm的末端吸收影响大。乙腈-0.2%磷酸溶液梯度洗脱时，丹参酮ⅡA与五味乙素分离较好，且保留时间适中。故选择乙腈-0.2%磷酸溶液为流动相。

3.3样品处理方法的确定 分别考察甲醇、75%甲醇对供试品的提取结果的影响，根据测定结果、空白实验及回收率实验证实，75%甲醇提取既能排除干扰，又可以达到提取完全。故选择75%甲醇为提取溶剂。另考察超声处理与加热回流及处理时间长短对实验的影响。结果表明超声30 min已基本提取完全，且超声处理与加热回流效果相差不大，故确定提取方式为超声处理30 min。