苦参碱对人体外培养宫颈癌HeLa细胞增殖的抑制作用*

程熠，郭秋云，于世英，黄南，秦凯，赵荆，熊慧华

(华中科技大学同济医学院附属同济医院1.肿瘤科；2.过敏反应科，武汉 430030)

近年来，宫颈癌发病率逐年递增，且呈年轻化趋势，所以寻找一种高效的治疗药物刻不容缓。研究发现，大部分中药提取物具有耐药性低、多靶点的优势，如珊瑚姜油[1]、莪术油[2]、蓝萼香茶菜[3]等，均已在细胞学水平上证实对宫颈癌HeLa细胞的抗癌活性[4]。最新研究证实，苦参碱(matrine,Mat)在体内外对肿瘤具有较好的抑制作用[5-6]。笔者在本研究重点分析Mat对人体外培养宫颈癌HeLa细胞增殖的抑制作用。报道如下。

1 资料与方法

1.1主要试剂 Mat(西安天园生物制剂公司，批号：16092517，含量：≥99%)；小牛血清(德国PAA公司)；达尔伯克改良伊格尔培养基(Dulbecco's modified eagle's medium,DMEM)(Hyclone 公司，批号：AD22391271)；二甲亚砜(DMSO，Sigma-Aldrich公司，批号：RNBF8134)；考马斯亮蓝染液(海门市碧云天生物技术研究所)；噻唑蓝(MTT，北京索莱宝科技有限公司，批号：M8180)；碘化丙啶(propidium iodide，PI，Sigma-Aldrich公司，批号：P4170)。

1.2仪器 培养箱(上海跃进医疗器械厂，型号：HWJ-3-270)；酶标仪(美国伯滕仪器有限公司，型号：Lx800)；倒置显微镜(日本Olympus公司，型号：ZXPO)。

1.3细胞培养 人宫颈癌HeLa细胞系为本医院实验室保存，培养环境为浓度为10%小牛血清，DMEM；在5%二氧化碳(CO2)、37 ℃恒温培养箱中贴壁生长。

1.4MTT法测定细胞增殖抑制率 将对数生长期宫颈癌HeLa细胞制成单细胞悬液，将细胞密度调整为每孔6×103个，在96孔培养板培养，每孔细胞悬液体积为200 μL，培养4～6 h后待细胞完全贴壁，贴壁后加入0.5，1.0，1.5和2.0 g·L-1Mat，设置对照组，每组设5个复孔，于72 h后停止培养。细胞形态及密度在倒置显微镜下观察，在每孔加入5 mg·mL-1MTT溶液20 μL，保持37 ℃培养箱内连续孵育4 h，弃上清液，每孔加入DMSO 150 μL，最后避光摇匀，10 min后采用酶标仪测定吸光度(A值)，波长为490 nm。细胞增殖抑制率(%)=(1-实验组/对照组)×100%。

1.5流式细胞术检测宫颈癌HeLa细胞周期分布 选取对数生长期HeLa细胞，使用不含血清的培养液培养12 h后，同步细胞周期，当细胞贴合度达到60%后，设置对照组，实验组加入2.0 g·L-1Mat，培养72 h，使用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗细胞2次，每孔2×106个，在4 ℃条件下，使用75%乙醇-20 ℃固定1 h，弃乙醇，使用PBS 400 μL重悬细胞后，依次加入核糖核酸酶A(ribonuclease A, RNaseA)20 μL，37 ℃水浴30 min，400目筛网滤过，加入PI 400 μL染色30 min，轻轻混匀后4 ℃避光孵育1 h，上机检测细胞周期比率，使用ModFit LT软件获取数据。

1.6Western boltting检测细胞周期相关蛋白Wee1、CyclinA、CDC2和CyclinB的变化

1.6.1蛋白样品制备 ①将对数生长期HeLa细胞培养液制备成单细胞悬液。②将细胞密度调整为每孔2×105个，在6孔培养板培养，每孔细胞悬浮液体积为2 mL，细胞贴壁后，弃液，分别在培养基2 mL加入浓度为0.5,1.0,1.5和2.0 g·L-1Mat，对照组加入无菌PBS溶液2 mL。③在冰上进行下述操作，利用4 ℃预冷PBS溶液冲洗细胞3次，弃PBS溶液。④每一个孔加入蛋白裂解液，置于冰上裂解10 min。⑤使用细胞刮将孔中细胞刮下置于预冷的EP试管中，在4 ℃条件下离心30 min,离心结束后将细胞置于冰上，备用。

1.6.2测量蛋白含量 使用考马斯亮蓝染液2 mL,按照1：1000的比例与蛋白样品混合均匀，利用分光光度仪测定蛋白质。

1.6.3蛋白变性 将2%β-巯基乙醇加入放射免疫沉淀分析(radio immunoprecipitation assay，RIPA)裂解液及蛋白液中，蛋白浓度保持1 mg·mL-1，煮沸10 min后置于冰上冷却，储于-70 ℃冰箱中备用。

1.6.4电泳 根据蛋白浓度配置对应的分离胶，在玻璃板夹层中均匀灌入，使用双蒸水封闭上层。在玻璃夹层中灌入对应比例的浓缩胶，插入梳子，30 min后将梳子拔出，煮沸蛋白样品50 μg，离心后8 V电泳30 min，后120 V电泳90 min。

1.6.5转膜 ①将蛋白区域内凝置于半干缓冲液中浸泡20 min。②切割滤纸和聚偏二氟乙烯(PVDF)膜，滤纸和甲醇活化PVDF膜60 s,置于半干转缓冲液中浸泡。③根据蛋白质分子量,在100 V恒压转膜1～2 h。

1.6.6封闭 使用5%脱脂牛奶室温封闭膜60 min。

1.6.7抗体孵育 ①膜使用1×Tris缓冲液-Tween (Tris buffered solution-Tween，TBST)清洗3次，每次10 min。②根据蛋白将抗体1×TBST/1%BSA稀释对应浓度，恒温4 ℃摇床孵育过夜。③膜使用1×TPBS清洗3次，每次10 min。④应用TBST将二抗稀释移动浓度，室温下摇床孵育60 min。⑤膜使用1×TBST清洗3次，每次10 min。

1.6.8洗膜 在洗膜盒中加入PVDF膜，底面向下，添加适量TBST液体洗涤3次，每次10 min。

1.6.9显影 将适量辣根过氧化氢酶显影液滴在膜表面，摄像保存凝胶成像系统。

2 结果

2.1不同浓度Mat对HeLa细胞增殖的影响 同一时间内，HeLa细胞增殖抑制率随着Mat浓度增加而升高(P<0.01)；HeLa细胞增殖抑制率随着Mat作用时间延长而升高(P<0.01)，HeLa细胞增殖抑制率与Mat浓度、作用时间相互关系明显(P<0.01)，HeLa细胞增殖抑制率在2.0 g·L-1Mat72 h中达到峰值，为(62.10±0.36)%，见表1。

表1 不同浓度Mat对HeLa细胞增殖抑制率的影响

2.2Mat对HeLa细胞周期的影响 流式细胞周期检测发现与对照组比较，2.0 g·L-1Mat诱导宫颈癌HeLa细胞凋亡比率上升明显(P<0.05)。见表2。

表2 Mat诱导宫颈癌HeLa细胞前后各细胞周期比率的变化

2.3Western boltting检测细胞周期相关蛋白表达 Western boltting检测不同浓度Mat处理细胞72 h后，发现周期相关蛋白Wee1呈上升趋势，CyclinA、CyclinB和CDC2呈下降趋势，见表3；2.0 g·L-1Mat处理相关蛋白Wee1上升明显，CyclinA、CyclinB和CDC2呈显著下降趋势(P<0.05)，见图1。

表3 不同浓度Mat对细胞周期相关蛋白质的影响

3 讨论

宫颈癌的发病是一个缓慢递进，受多种因素影响，又相互制约的复杂过程。涉及病灶细胞不规则生长，细胞外基质被降解、间质中进入原发瘤细胞、间质中瘤细胞移动并与脉管接触、瘤细胞脱离血管内皮进入血液，形成病灶转移[7]。现阶段药物化疗是治疗宫颈癌的重要方式之一，但会对正常组织产生损伤，局限其临床应用。传统中药具有副作用小、抗肿瘤效果明确的优势，成为临床研究的重点话题。开发中药分子水平的中药学作用机制，逐步开发新型抗癌药物作为治疗肿瘤手段的潜力。

图1 Mat处理HeLa细胞后周期相关蛋白质的表达

Mat是苦参干燥根中提取的生物碱活性成分，临床药理学应用较广泛。近年研究发现，Mat对结肠癌、胃癌、乳腺癌等肿瘤细胞增殖具有抑制作用，可诱导肿瘤细胞凋亡，发挥抗肿瘤作用[6,8]。也有研究显示，Mat可有效抑制裸鼠体内成瘤能力和体外宫颈癌HeLa细胞的增殖能力[9]。Mat可通过多种作用机制抑制肿瘤细胞增殖：①它可通过限制肿瘤细胞正常代谢，抑制端粒酶的活性及表达，使DNA模式甲基化，改变细胞信号抑制肿瘤细胞增殖；②通过抑制肿瘤细胞凋亡，降低肿瘤细胞的黏附力，继而抑制肿瘤细胞转移；③通过抑制肿瘤细胞的炎症发展，降低化疗药物的毒副作用，降低肿瘤细胞的耐药性，抑制肿瘤细胞增殖[7-9]。

中药抗癌的主要作用机制可能诱导肿瘤细胞凋亡[10]。本实验结果显示，Mat能够有效抑制体外培养宫颈癌HeLa细胞的增殖，诱导肿瘤细胞凋亡，与SJAO等[11]研究结果相似。本次实验结果发现，同一时间内，HeLa细胞增殖抑制率随着Mat浓度增加而升高，HeLa细胞增殖抑制率随着Mat作用时间增加而升高。符合GUO等[12-13]临床研究结果，后者研究指出Mat可通过诱导宫颈癌细胞凋亡抑制肿瘤细胞增殖，说明Mat在治疗宫颈癌方面具有较高的临床价值。HeLa细胞增殖抑制率与Mat浓度、作用时间相互关系明显，宫颈癌HeLa细胞增殖抑制率在2.0 g·L-1Mat72 h中达到峰值，浓度2.0 g·L-1和作用时间72 h为本次实验最高浓度和最长时间，增加浓度或延长时间能否抑制作用更强，仍有待研究。

细胞的生长、增殖和分化均受细胞内外多种信号调控，多种信号在细胞内发挥作用，促进细胞增殖或诱导细胞凋亡。当发生基因突变时，细胞就会失衡，出现无限增殖，形成肿瘤。Cyclin细胞家族是在细胞转换和进行的关键蛋白质[14]。其表达水平与细胞周期密切相关，可结合特定的蛋白激酶发挥活性，从而调控细胞各个周期代谢增殖。CyclinA浓度在细胞进入S周期时到达高峰，而HeLa细胞的特点是恶性增生，细胞周期运行过程中，CyclinA直接调节细胞增殖，细胞分化越差，CyclinA表达水平越低。由此推测HeLa细胞增殖水平逐渐下降，CyclinA水平降低。CyclinA位于细胞核，在DNA形成前出现，较CyclinB之前表达，在G1和S1期之间形成屏障隔离，CyclinB大量存在于细胞质中，在S晚期到达峰值。研究显示，CyclinB在多种肿瘤细胞中高表达呈现出肿瘤特性。由此推测Mat通过诱导HeLa细胞凋亡，导致CyclinB浓度降低。Wee1蛋白激酶是苏氨酸蛋白家族的一员，可通过抑制CDC2的活性限制细胞有丝分裂，减少真核生物体积[15]。在机体中，Wee1蛋白含有647个氨基酸，在胚细胞和体细胞中均表达丰富。Wee1蛋白激酶的调节主要包括Wee1蛋白激酶的特定位点的磷酸化和Wee1蛋白激酶的降解两部分。Wee1蛋白激酶的降解是泛素依赖的蛋白质降解，M期是蛋白质降解主要时期，因为CDK1的激活，对恢复被DNA损伤检查激活引起的停止的细胞周期是必不可少的。在肿瘤细胞中Wee1蛋白激酶与被磷酸化的Ser53和pS121位点相结合发生降解，研究显示，Wee1蛋白与DNA诱导的细胞凋亡密切相关[16]。由此推测在形成HeLa细胞降解时期Wee1持续增高。本次实验研究显示，Western boltting检测不同浓度Mat处理细胞72 h后发现周期相关蛋白Wee1呈上升趋势，CyclinA、CyclinB和CDC2呈下降趋势，在1.5和2.0 g·L-1Mat处理组4个蛋白表达水平与对照组相比差异有统计学意义，说明Mat可有效改变体外培养的宫颈癌HeLa细胞，通过提升蛋白Wee1水平促进细胞凋亡，降低CyclinA、CyclinB和CDC2水平抑制细胞增殖。

综上所述，Mat对体外培养宫颈癌HeLa细胞抑制作用明显，可能通过诱导细胞凋亡、阻断细胞周期进程来实现,为临床应用中药治疗宫颈癌提供了新思路。