七氟烷对幼年大鼠短期认知功能的影响及其机制*

龚涛武，郑雪，杨洋，林夏妃，吴振宇，朱昭琼

(1.遵义医学院附属医院麻醉科，遵义 563000；2.贵州省遵义市妇幼保健院麻醉科，遵义 563000；3.遵义医科大学，遵义 563000)

随着社会的快速发展和医疗技术的进步，接受手术治疗的患儿日渐增多，而患儿家属比较关注全身麻醉后是否会影响患儿的学习记忆能力。认知功能障碍以意识受损和思维模式紊乱为特征，发生后可导致患者学习能力的下降、记忆受损、人格改变等，甚至影响到患者术后的康复，已经成为社会关注的热点问题[1]。研究发现七氟烷可能会引起认知功能障碍的发生[2-3]。笔者在本研究对幼年大鼠进行七氟烷麻醉处理，观察其认知功能所受到的影响及可能的发生机制，为七氟烷的临床使用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1实验动物 健康雄性SD幼年大鼠30只，8周龄，体质量220～250 g，由重庆第三军医大学实验动物中心提供，实验动物生产许可证号：SCXK(渝)2012-0005。

1.2试药 七氟烷(山东鲁南贝特制药有限公司，批号：65170507)；磷脂酰肌醇3激酶(phosphoinositide 3-kinase,PI3K)p85(α)抗体(武汉proteintech公司)、蛋白激酶B(protein kinase B,AKT)抗体(武汉proteintech公司)、羊抗鼠IgG(H+L)抗体、β-action(1：1000)、BCA蛋白定量试剂盒均由北京绿泽森生物技术有限公司提供。

1.3仪器 化学发光成像系统(美国BioRad公司)。Morris 水迷宫测试仪(成都泰盟科技有限公司)；DragerFabius麻醉机，Vamos气体监护仪(Drager公司，德国)；自制吸入麻醉箱。

1.4动物分组及给药方法 采用随机数字表法分为空白对照组(K组)，模型对照组(C组)和实验组。实验组分为4个亚组，分别为吸入2%七氟烷30 min后苏醒2 h(Sev-2 h组)、12 h(Sev-12 h组)、24 h(Sev-24 h组)、72 h(Sev-72 h组)，每组5只。K组大鼠不做任何处理，C组大鼠于自制麻醉箱中吸入纯氧30 min，Sev-2 h、Sev-12 h、Sev-24 h、Sev-72 h组大鼠分别吸入七氟烷30 min。自制密闭吸入麻醉箱内铺垫厚钠石灰，通过控制挥发罐刻度使大鼠吸入七氟烷浓度始终维持在2.0%。K组、C组及Sev-2 h、Sev-12 h、Sev-24 h、Sev-72 h组分别吸入空气、氧气、七氟烷30 min后完全苏醒2，12，24，72 h后再次进行定位航行实验和空间搜索实验，所有记录数据同麻醉前。

1.5Morris水迷宫实验 适应性训练1 d：以适应环境，剔除不会游泳的大鼠。连续5 d的定位航行实验：标记四个象限，平台距离水面2 cm。将大鼠面向池壁依次由4个象限中点入水，限定大鼠在120 s内找到并爬上平台休息10 s，若120 s内未找到，则指引其找到并置于平台上休息10 s，记录逃避潜伏期和游泳总路程。空间探索实验：定位航行实验结束后次日撤去平台，将所有大鼠从同一平台象限入水，游泳120 s，记录有效区域运动时间、有效区域运动距离和有效区域进入次数。Sev-2 h、Sev-12 h、Sev-24 h、Sev-72 h组再次行Morris水迷宫实验并取材，K组、C组与Sev-2 h组于同一时间处理。

1.6血浆PI3K/AKT蛋白表达的检测 Morris水迷宫实验结束当天，各组5只大鼠分别腹腔注射1%戊巴比妥钠30 mg·kg-1，麻醉生效后取腹主动脉血5 mL，离心10 min，取上层血浆，-40 ℃保存待测。取出保存血浆标本常温解冻，用BCA蛋白试剂盒测定总蛋白量。电泳：配制12%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)，浓缩胶为80 V，30 min，分离胶为120 V，75 min。转膜：电泳结束后，在4 ℃冰水混合物下将蛋白转至聚偏氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜(300 mA ，90 min)。封闭：PVDF膜转移至塑料平皿中，5%脱脂牛奶封闭120 min，TBST洗膜，加入PI3K p85(α)一抗(1：4000)或AKT一抗(1：4000)，4 ℃孵育过夜，第2天，TBST洗膜3次，每次15 min，孵二抗(1：8000)，于37 ℃温箱孵育50 min，TBST清洗3次，每次15 min，电化学发光(electrochemiluminescence，ECL)液曝光，经化学发光成像系统采集，以条带灰度反映PI3K和AKT的表达。

2 结果

2.1Morris水迷宫实验结果 所有幼年大鼠麻醉前进行水迷宫训练，逃避潜伏期与总路程随着时间的推移逐渐缩短，第3天后形成稳定的空间学习记忆能力。见表1。

与K组、C组比较，Sev-2 h组逃避潜伏期、游泳总路程明显延长，差异有统计学意义(P<0.05)；与Sev-2 h组比较，Sev-24 h组、Sev-72 h组逃避潜伏期、游泳总路程缩短，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

与C组比较，Sev-2 h组麻醉后有效区域运动时间、有效区域运动距离缩短，差异有统计学意义(P<0.05)；与Sev-2 h组比较，Sev-24 h、Sev-72 h组有效区域运动时间、有效区域运动距离明显延长，差异有统计学意义(P<0.05)。各组有效区域进入次数差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。

表1 水迷宫训练逃避潜伏期与总路程

表2 6组大鼠逃避潜伏期与总路程

2.2PI3K、AKT表达结果 与K组、C组比较，Sev-2 h组PI3K、AKT表达下降，差异有统计学意义(均P<0.05)；与Sev-2 h组比较，Sev-24 h组、Sev-72 h组PI3K、AKT表达上调，差异有统计学意义(均P<0.05)。见图1。

3 讨论

七氟烷作为目前临床上常用的吸入麻醉或复合麻醉的常用药物，具有血气分配系数低、麻醉诱导和苏醒迅速、呼吸道刺激小、芳香味和不易燃等优点，尤其在小儿全麻诱导和维持中的优势显著[4]。近年来，有研究报道，啮齿类动物在七氟烷麻醉后可能会造成短期学习、记忆功能下降，许多临床观察发现儿童暴露在七氟烷麻醉会造成认知功能损伤，且多发生于术后1～3 d，其具体机制至今仍不明确[5-6]。2%七氟烷是临床麻醉常用浓度，为与临床相结合，同时参考文献[7]，本研究选择2%七氟烷作为麻醉处理的浓度。

表3 6组大鼠空间探索实验结果

与K组比较，*1P<0.05；与C组比较，*2P<0.05；与Sev-2 h组比较，*3P<0.05。

Morris水迷宫是用于评价啮齿类动物的空间学习和记忆能力的经典实验，在神经认知障碍的相关研究中得到了广泛的应用，但是否适用于测量动物的长时记忆还存在争议[8]。因此，本研究以2%七氟烷麻醉幼年大鼠，并选择Morris水迷宫实验检测幼年大鼠短期内不同时间段的空间回忆探究能力。行为学结果显示，Sev-2 h组逃避潜伏期、游泳总路程明显较K组、C组延长。与C组比较，Sev-2 h组麻醉后有效区域运动时间、有效区域运动距离明显缩短，表明幼年大鼠吸入2%七氟烷后2h出现明显的学习记忆能力下降，而在12 h后幼年大鼠的空间学习记忆能力逐渐恢复。

PI3K/Akt信号通路作为一种重要的信号转导通路，参与细胞凋亡、存活和增殖等多种细胞过程。PI3K是一种胞内磷脂酰肌醇激酶，由催化亚基(p110)和调节亚基(p85)组成。Akt是丝氨酸/苏氨酸激酶，是PI3K信号转导通路的主要下游靶点。AKT是促进细胞损伤后存活的关键成员。多项研究表明，通路及其下游激酶可促进细胞增殖，抑制细胞凋亡，AKT可激活多种蛋白激酶，AKT的活化可诱导蛋白磷酸化，促进细胞增殖，抑制细胞凋亡[9]。PI3K/AKT信号通路在神经系统中广泛存在，通路的激活可抑制神经细胞凋亡、改善神经形态、增强突触可塑性、减轻神经损伤、减少炎症细胞死亡[10-11]。本研究血浆Western blotting结果显示，与K组、C组比较，Sev-2 h组PI3K、AKT蛋白表达明显下降，12 h后蛋白表达量逐渐恢复，这与行为学的结果吻合，提示七氟烷麻醉后引起的幼年大鼠认知功能障碍可能与血浆PI3K、AKT蛋白的表达下调有关。这与本课题组前期实验幼年大鼠吸入2%七氟烷麻醉后海马中PI3K mRNA、AKT mRNA的表达结果一致[12]。本次研究未对幼年大鼠的海马进行PI3K、AKT蛋白检测对比为不足之处，课题组后期将会做进一步研究。

综上所述，幼年大鼠在吸入2%七氟烷麻醉后发生短暂的认知功能障碍，而其机制可能与PI3K/Akt信号通路被抑制有关。