钙卫蛋白S100A8/A9对口腔鳞癌细胞增殖和迁移的影响*

鲍玲娜， 马洪*， 李超

(1.贵州医科大学附属口腔医院 口腔颌面外科， 贵州 贵阳 550004； 2.四川省肿瘤医院 研究所&四川省癌症防治中心 头颈外科， 四川 成都 610000)

口腔鳞状细胞癌(oral squamous cell carcinoma，OSCC)是发生于口腔颌面部最常见的恶性肿瘤，具有侵袭能力强、淋巴结转移快、恶性程度高及预后不良等特点[1]，即使诊疗技巧在过去的数十年中有不断的提高，OSCC的复发率及转移率仍然居高不下，5年生存率依旧较低[2]；与此同时，诊疗的延迟通常会导致更高的死亡率，因此探析OSCC细胞发展的分子机制、识别和鉴定与OSCC转移相关的肿瘤标志物一直是学者们的研究热点[3]。钙卫蛋白S100A8蛋白和S100A9蛋白是S100蛋白家族的重要成员，每个单体包含4个α-螺旋(HⅠ，HⅡ，HⅢ和HⅣ)和2个环(环Ⅰ和环Ⅱ)，S100A8和S100A9蛋白基因定位在1q21染色体上，该区域染色体易发生突变、稳定性差、易缺失，因此与肿瘤的进展密切相关[4-5]。钙卫蛋白S100A8/A9是S100A8蛋白和S100A9蛋白以Ca2+依赖形式形成的异二聚体复合物，主要在细胞增殖和运动、细胞周期的调整、细胞分化及肿瘤相关信号通路中发挥重要作用[4-6]。头颈部鳞癌研究发现，S100A8/A9蛋白在口腔癌、鼻咽癌中表达上调[7-8]，在食管癌中表达下调[9]，OSCC患者唾液中S100A8蛋白及S100A8/A9蛋白呈高表达[7]；OSCC组织中S100A8蛋白、S100A9蛋白较正常口腔黏膜组织的表达明显增高，且中低分化组表达高于高分化组[10-13]，这些研究均提示S100A8蛋白、S100A9蛋白及S100A8/A9蛋白可能在OSCC的进展中发挥重要的作用，但具体影响尚不清楚。因此，本实验拟探讨钙卫蛋白S100A8/A9对OSCC细胞增殖和迁移能力的影响，报告如下 。

1 材料与方法

1.1 主要试剂和仪器

人舌鳞状细胞癌细胞SCC-25购自美国模式菌种收集中心，DMEM/F-12培养基、胰蛋白酶、青链霉素混合液购自美国Gibco公司，Transwell小室、离心管、细胞培养瓶、孔板购自美国BD公司，CCK-8试剂盒购自Biosharp公司，LA2-A生物安全柜购自新加坡ESCO公司，Synergy H4多功能酶标仪购自美国Hybrid公司，CKX41倒置显微镜购自日本OLYMPUS公司。

1.2 方法

1.2.1OSCC细胞的培养及传代 SCC-25细胞培养于DMEM/F-12培养基(含10%胎牛血清和1%青链霉素混合液)中，37 ℃、5% CO2条件下于细胞培养箱内培养，待细胞生长至80%～90%时进行传代。

1.2.2CCK-8法检测细胞增殖能力 根据文献[13]将S100A8和S100A9人重组蛋白以质量比1 ∶1均匀混合，置于4 ℃，1 h使之结合形成复合物S100A8/A9以发挥其生物学效应。取对数生长期SCC-25细胞清洗、消化并接种于96孔板中，使每孔约含1 000个细胞，于各孔中分别添加5 mg/L、10 mg/L、20 mg/L、30 mg/L和40 mg/L S100A8/A9蛋白，以不接种细胞的空白培养基对照孔作为空白调零孔，以0 mg/L S100A8/A9蛋白的孔为对照孔，分别在24 h及48 h时加入10 μL CCK-8试剂混匀，在细胞培养箱内继续培养1.5 h后于酶标仪450 nm波长处检测吸光度值(optical density，OD)，调零并取3个复孔的平均值，以0 mg/L S100A8/A9蛋白浓度为基点，以各浓度S100A8/A9蛋白OD值与对照组OD值的比值绘制细胞增殖曲线。

1.2.3Transwell小室实验 取对数生长期SCC-25细胞清洗、消化、重悬并调整细胞浓度约1×105个/mL，接种200 μL于Transwell小室内，下室内添加500 μL完全培养基。实验组添加5 mg/L S100A8/A9蛋白(该浓度为CCK-8实验结果中促增殖作用范围内浓度，本着节约原则，后续实验均采用5 mg/L作为实验浓度)，24 h后取出Transwell小室，清洗并于4%多聚甲醛固定30 min，0.1%结晶紫中染色15 min，清洗、风干并于倒置显微镜下随机选取5个视野拍照，合计每个视野中的穿聚碳酸酯膜细胞数 。

1.2.4划痕实验 取对数生长期SCC-25细胞清洗、消化、重悬并调整细胞浓度约1×105个/mL，接种2.0 mL细胞悬液于6孔板中，设置对照组及添加5 mg/L S100A8/A9蛋白的实验组，置于37 ℃、5%CO2条件下培养0 h、24 h、48 h和72 h，拍照。

1.3统计学分析

2 结果

2.1 CCK-8细胞增殖实验

CCK-8细胞增殖实验结果显示，5、10、20、30和40 mg/L钙卫蛋白S100A8/A9作用下SCC-25细胞24 h时的增殖能力强于对照组(0 mg/L)，差异有统计学意义(P<0.05)；5、10、20和30 mg/L钙卫蛋白S100A8/A9作用下SCC-25细胞48 h时的增殖能力表现出相同趋势，但40 mg/L钙卫蛋白S100A8/A9作用下SCC-25细胞48 h时的增殖能力较对照组减弱，差异有统计学意义(P<0.05)。见图1。

注：A为24 h，B为48 h；(1)与对照组(0 mg/L)比较，P<0.05。图1 不同浓度S100A8/A9蛋白对SCC-25细胞增殖的影响Fig.1 Effect of different concentrations of S100A8/A9 on the proliferation of SCC-25 cells

2.2 Transwell 小室实验

Transwell 小室实验结果显示，5 mg/L钙卫蛋白作用的实验组穿过聚碳酸酯膜的细胞数目多于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，提示5 mg/L钙卫蛋白促进SCC-25细胞侵袭和迁移。见图2、图3。

2.3 划痕实验

划痕实验结果显示，5 mg/L钙卫蛋白作用的实验组在24、48、72 h的细胞划痕面积明显小于对照组，提示5 mg/L S100A8/A9蛋白作用于SCC-25细胞可促进其迁移 。见图4。

3 讨论

S100蛋白家族是Ca2+结合家族中最大的亚类，可以参与细胞增殖、细胞侵袭转移、肿瘤血管生成和免疫逃避等致瘤过程[4-5]。这个过程的原因主要在于[3，14-15]：(1)S100蛋白的基因主要位于人类染色体1q21上，该区域不稳定，易发生突变；(2)一些肿瘤对S100蛋白的表达具有差异性；(3)许多S100蛋白通过与特定的靶蛋白如NF-κB、p53和β-catenin等相互作用而参加肿瘤的的进展。有研究认为，S100A8/A9蛋白作为一种智能分子，其功能依赖于在细胞内外的浓度和位置；研究发现，在不同恶性肿瘤中S100A8/A9蛋白浓度范围介于20～250 mg/L时，可通过抑制细胞内锌离子或与受体的相互作用而产生凋亡诱导活性，从而促进肿瘤细胞凋亡；较低水平(<10～25 mg/L)的S100A8/A9蛋白则能促进肿瘤细胞、血管内皮细胞和炎症细胞的存活或迁移，通过RAGE依赖的信号转导及MAPK途径和NF-κB的激活而促进肿瘤细胞的增殖[8，16-17]。因此，在不同肿瘤中，S100A8/A9蛋白对细胞增殖及抑制作用浓度不同，但趋势相同。另外，近年来S100A8蛋白、S100A9蛋白和S100A8/A9蛋白的促炎和抗炎功能亦有报道，提示S100A8/A9蛋白的功能是具有浓度依赖性的，并且可受局部环境的细胞和生化组成的影响[18]。本研究结果显示，5、10、20、30和40 mg/L钙卫蛋白S100A8/A9作用下SCC-25细胞24 h时的增殖能力强于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；5、10、20和30 mg/L钙卫蛋白S100A8/A9作用下SCC-25细胞48 h时的增殖能力表现出相同趋势，但40 mg/L钙卫蛋白S100A8/A9作用下SCC-25细胞48 h时的增殖能力较对照组减弱，差异有统计学意义(P<0.05)，提示本实验总体趋势与其他学者研究结果大致符合。

注：(1)与对照组比较，P<0.05。图2 钙卫蛋白S100A8/A9对SCC-25细胞迁移的影响Fig.2 Effect of different concentrations of S100A8/A9 on the migration ability of SCC-25 cells

图3 钙卫蛋白S100A8/A9对SCC-25细胞迁移的影响(结晶紫染色)Fig.3 Migration of SCC-25 cells in Transwell chambers

图4 S100A8/A9蛋白对SCC-25细胞迁移影响Fig.4 Effect of S100A8/A9 on the wound healing assay of SCC-25 cells

据肿瘤细胞侵袭转移途径理论认为，肿瘤细胞首先从原发部位脱落，然后侵入到细胞外基质与基底膜及细胞间质中一些分子黏附，并激活细胞合成、分泌各种降解酶类，协助肿瘤细胞穿过细胞外基质进入血管，然后在某些因子作用下运行并穿过血管壁外渗到继发部位，增殖形成转移灶[19]。划痕实验是在细胞生长并融合成单层状态时，在其上制造一个空白区域，划痕边缘的细胞会逐渐进入空白区域使其逐渐愈合，从而了解细胞的迁移情况。本研究结果显示，5 mg/L钙卫蛋白作用的实验组穿过聚碳酸酯膜的细胞数目多于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，同时在24、48及72 h后细胞划痕面积明显小于对照组，提示5 mg/L S100A8/A9蛋白作用于SCC-25细胞可促进其迁移，但具体的机制有待进一步研究。

综上所述，本研究结果提示5 mg/L钙卫蛋白S100A8/A9能够促进SCC-25细胞的增殖和迁移。