干扰素对人Burkitt's淋巴瘤细胞Raji增殖的影响及机制*

谭大为， 郑丹， 陈秀萍

(1.贵州医科大学附属白云医院 血液内科， 贵州 贵阳 550014； 2.贵阳护理职业学院， 贵州 贵阳 550081； 3.毕节市七星关区人民医院， 贵州 毕节 551700)

淋巴瘤是起源于淋巴造血系统的恶性肿瘤，发病原因不明，通常认为与病毒感染有直接关系，最为常见是EB病毒(EBV)感染[1]。研究表明，EBV感染与淋巴瘤的关系密切[1-2]，EBV感染相关淋巴瘤主要包括Burkitt淋巴瘤、B细胞增殖性疾病、霍奇金淋巴瘤、T细胞淋巴瘤等[3-5]。现行淋巴瘤的治疗方案仍然以化疗为主[4]。临床上EBV阳性与EBV阴性淋巴瘤的治疗和预后有较大的区别[5]，研究发现，通过常规化疗，85%的EBV阴性淋巴瘤病例可达到5年无病生存，EBV阳性淋巴瘤病例中可达到5年无病生存的病例仅为60%[6-9]，提示EBV阳性淋巴瘤患者的治疗较为困难。在常规化疗过程中联合抗病毒治疗EBV，以期达到更好的疗效及预后，是探寻EBV阳性淋巴瘤治疗方案的一个研究方向。干扰素是广谱抗病毒药，对EBV感染有一定的治疗作用[10-11]。本研究采用干扰素处理EBV阳性人Burkitt's淋巴瘤细胞株Raji细胞，观察其对Raji细胞增殖的影响及可能机制，为EBV阳性淋巴瘤的临床治疗提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 细胞及主要试剂

人Burkitt's淋巴瘤细胞Raji(编号TCHu 44)购于上海中国科学院细胞库，RPMI l640培养基、胎牛血清购自美国GIBCO公司产品，CCK8试剂盒购自美国Sigma公司产品，干扰素购自北京三元基因工程有限公司生产(母液为3 000 000 U/mL)；反转录试剂盒购自日本takara公司产品，RT试剂、QPCR试剂、sybr green I购自重庆威斯腾生物医药科技有限责任公司，BRLF1、BZLF1引物由重庆威斯腾生物医药科技有限责任公司合成。BRLF1引物序列：上游为GAAGAAACCAGTCAGGCCGT，下游为TGTTGTGGTCAGTTCGTCCA，产物大小为141 bp。BZLF1引物序列：上游为GGGGCTAACCAAGGACAACA，下游为 ATTCCTCCAGCGATTCTGGC，产物大小为112 bp。内对照GAPDH引物序列：上游为AGATCCCTCCAAAATCAAGTGG，下游为GGCAGAGATGATGACCCTTTT，产物大小为130 bp。

1.2 方法

1.2.1细胞培养 Raji细胞用含10%胎牛血清RPMI l640培养基，在37 ℃、5% CO2条件下培养，1～2 d换液1次，取对数生长期细胞用于后续研究。

1.2.2细胞处理 取对数生长期Raji细胞，分别用100、500、1 000、2 000及5 000 U/mL干扰素处理12、24及48 h，分别检测细胞增殖活性。根据结果选择最佳检测时间，收集细胞，提取DNA，检测其BZLFl、BRLFl基因的表达水平。研究设立对照，Raji细胞不用干扰素处理。

1.2.3细胞增殖活性 采用CCK-8法，分别取不同浓度干扰素处理12、24及48 h的Raji细胞，加入CCK-8溶液10 μL，继续孵育4 h，用酶标仪测定450 nm处的吸光度值(OD450)。计算细胞活力及抑制率：细胞活力(%)=[(实验组OD450-空白组OD450)/(对照组OD450)-空白组OD450)]×100%，细胞抑制率(%)=(对照组OD450-实验组OD450)/(对照组OD450)。

1.2.4BZLFl及BRLFlmRNA表达 采用实时荧光定量PCR (QPCR)检测，(1)cDNA合成：收集不同浓度干扰素处理48 h的Raji细胞，Trizol提取总RNA，配制10 μL反应液[包括Random 6mers(50 μmol/L)1 μL、dNTP mixture(10 mmol/L)1 μL、总RNA 5 μL及ddH2O 3 μL]进行反转录，先将反应液在65 ℃保温5 min后冰上迅速冷却，配制反转录体系，包括变性后反应液10 μL、5×PrimeScript 2 Buffer 4 μL、40 U/μL RNase lnhibitor 0.5 μL、200 U/μL PrimeScript 2 RTase 1 μL、ddH2O补足体积至20 μL；反应条件为30 ℃ 10 min、42 ℃ 60 min、95 ℃ 5 min，冰上冷却。(2)QPCR扩增反应体系：2×PowerUp SYBR Green Master Mix 5 μL、BZLFl或BRLFl基因上下游引物各0.5 μL、反转率产物1 μL、ddH2O补足体积至10 μL，反应条件为50 ℃预变性2 min，95 ℃变性2 min、60 ℃退火1 min、95 ℃延伸15 s，40次循环。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 Raji 细胞增殖活性

CCK-8法结果显示，100、500、1 000、2 000及5 000 U/mL干扰素分别处理 Raji细胞12、24及48 h后， 5个浓度的干扰素对Raji细胞增殖均有一定抑制作用，且随着浓度增加及作用时间延长，抑制作用增强，各组间比较差异有统计学意义(P<0.05)。见图1、表1。

图1 不同浓度干扰素对Raji细胞增殖的影响Fig.1 Interferon inhibit proliferation of Raji cells

2.2 Raji细胞BZLFl、BRLFlmRNA的表达

根据CCK-8的实验结果，选择干扰素处理Raji细胞48 h后检测细胞BZLFl、BRLFlmRNA表达水平。BZLFl、BRLFlQPCR结果显示，其CT值为单一曲线，其溶解曲线为单一峰值，说明结果可信；统计结果显示，不同浓度干扰素分别处理Raji细胞48 h后，Raji细胞BZLFl、BRLFlmRNA的表达水平均显著上调，且随着药物浓度的增加而增加，各组比较差异有统计学意义(P<0.05)。见图2、表2。

表1 干扰素抑制 Raji 细胞增殖Tab.1 Interferon inhibit proliferation of Raji cells

注：(1)与对应时间点其他浓度组比较，P<0.05；(2)与相同浓度其他时间点比较，P<0.05。

图2 BZLFl、BRLFlmRNA表达QPCR结果及溶解曲线Fig.2 QPCR results and dissolution curves of BZLFl and BRLFl mRNA expression

表2 干扰素上调Raji细胞BZLFl及BRLFl mRNA表达Tab.2 Interferon upregulate the expression of BZLFl mRNA and BRLFl mRNA in Raji cells

注：(1)与对照组比较，P<0.05；(2)与100 U/mL干扰素组比较，P<0.05；(3)与500 U/mL干扰素组比较，P<0.05；(4)与1 000 U/mL干扰素组比较，P<0.05；(5)与2 000 U/mL干扰素组比较，P<0.05。

3 讨论

大量研究结果表明，EBV与多种人类肿瘤疾病有关，如传染性单核细胞增多症、淋巴瘤、鼻咽癌等[12-15]。有文献报道，EBV阳性的淋巴瘤患者较EBV阴性的淋巴瘤患者预后差[16-19]，因此，去除EBV感染的B细胞是目前预防和治疗EBV相关淋巴瘤的一大策略。EBV感染人体包括潜伏感染或增殖感染两种形式，其中以潜伏感染最为常见，EBV感染者中90%以上的人终身潜伏感染[20-22]。EBV感染首选的治疗方法是抗病毒治疗。目前常用的抗病毒药物主要是阿昔洛韦和更昔洛韦等嘌呤核苷类似物。这些药物进入细胞后需要在病毒编码的激酶作用下三磷酸化，形成有活性的形式。但是，EBV潜伏感染的淋巴瘤细胞不表达病毒编码的激酶，因此这类抗病毒药物不能取得很好的治疗效果。所以治疗EBV阳性淋巴瘤中的EBV需要诱导EBV从潜伏感染转化为增殖感染[23-24]。EBV潜伏感染时，基因组环化成游离体并持续存在于细胞内，宿主细胞基因复制时，病毒基因也随之复制，病毒此时只表达一部分基因。EBV增殖感染时，基因组是线性的，表达大量的病毒结构基因和调节基因，如BZLFl、BRLFl等，复制出新的病毒，并感染新的宿主细胞。BZLFl、BRLFl是EBV的即早基因，EBV进入增殖感染的起始很大程度上依赖于BZLFl、BRLFl两个基因的表达。干扰素具有抗病毒、抑制细胞增殖、调节免疫及抗肿瘤作用，广泛用于治疗恶性肿瘤、急慢性丙型病毒性肝炎、慢性活动性乙型肝炎、肝纤维化(早期肝硬化)、感染与损伤性疾病、骨髓增生异常综合症、病毒性疾病、系统性硬皮病、异位性皮炎、风湿性关节炎等；在EBV感染中，亦有较好的治疗效果[25-28]。但干扰素临床用于淋巴瘤的治疗目前存在争议。本研究采用不同浓度干扰素作用Raji细胞，于不同时间点观测其对Raji细胞增殖的影响，结果表明干扰素100 U/mL作用12 h即可抑制Raji细胞的增殖，且随着干扰素浓度的增加及作用时间延长，抑制作用增强，干扰素作用12、24、48 h的IC50分别为10 346.6、6 726.2、4 991.7 U/mL。另外，干扰素100～5 000 U/mL的浓度均能上调Raji细胞BZLFl、BRLFlmRNA的表达。而BZLFl、BRLFl是诱导EBV进入增殖感染的始动基因，EBV进入增殖感染，能够激发宿主免疫系统来杀伤EBV和被感染的细胞。

综上所述，本研究发现干扰素能够有效地抑制Raji细胞增殖，并且通过上调BZLFl、BRLFlmRNA的表达诱导其进入增殖感染，这为干扰素临床应用于淋巴瘤的治疗，特别是EBV阳性淋巴瘤的治疗提供了实验依据，从而为淋巴瘤临床治疗提供了新的治疗方案。