丙泊酚对小鼠外侧下丘脑促觉醒脑区的作用及觉醒和意识水平的影响*

王文聪，张超，刘利元,3，陈杨，张铭，易斌，鲁开智，杨明友**

(1.陆军军医大学第一附属医院 手术麻醉科， 重庆 400038； 2.重庆三博江陵医院 麻醉科， 重庆 400021； 3.中国人民解放军77611部队， 西藏 拉萨 850000)

临床上，丙泊酚是常用全身麻醉的诱导和维持药物[1]。临床实践和动物实验表明，丙泊酚麻醉具有起效快、无残留及醒后无宿醉感的优点[2-4]。丙泊酚产生麻醉效应的神经机理尚不完全清楚，研究认为丙泊酚可调控学习记忆相关的海马活动，抑制海马锥体神经元放电，抑制突触传递和可塑性，并减少各种兴奋性递质的释放，进而引起麻醉中认知功能下调[5-6]，丙泊酚也可直接抑制额叶皮层和内嗅皮层等脑区活动[7]。已有研究揭示，外侧下丘脑与觉醒、意识高度相关[8]。脑炎病毒感染损害外侧下丘脑后，可引起严重嗜睡、觉醒及警觉水平下降。近来，采用毁损实验、光遗传和神经药理实验，发现毁损或抑制外侧下丘脑可抑制觉醒产生，相反激活外侧下丘脑则可诱发睡眠向觉醒的转换[8]。本研究将探讨丙泊酚是否对作用下丘脑对觉醒与警觉功能产生影响。

1 材料与方法

1.1 动物、主要试剂及仪器

20只C57小鼠，动物由陆军军医大学动物中心提供，体质量25 g，雄性；试剂丙泊酚，多聚甲醛及DAPI购置于Tocris公司；微量注射泵(IVM-1000,英国Scientifica)，德国Leica冰冻切片机，生理采集处理系统(AWG5200，泰盟)，脑立体定位仪(中国瑞沃德)，脑电与肌电记录电极(中国瑞沃德)。

1.2 方法

1.2.1给药导管和脑电(EEG)与肌电(EMG)电极埋置 将小鼠用1%戊巴比妥钠麻醉，固定于脑立体定位仪上，用碘伏、酒精依次消毒，除去颅骨表面软组织，暴露颅骨及前囟和后囟点。记录EEG的不锈钢螺丝(直径1 mm)电极埋置于分别埋置于额叶(以前囟为标志，向前1 mm，中线旁开1.5 mm，深0.8 mm)与顶叶(以前囟为标志，向后2 mm，中线旁开1.5 mm，深0.8 mm)。两根采集EMG的电极埋置于左右颈部肌肉。通过记录动物的EEG与EMG检测睡眠觉醒状态。以前囟为标志，外侧下丘脑给药导管定位坐标前囟后1.65 mm，中线旁开1.2 mm，深4.8 mm，用牙科钻在颅骨表面钻孔。用牙科水泥将EEG与EMG记录电极和导管固定于颅骨表面。完成手术后，将小鼠放置于养笼中恢复。

1.2.2分组及微量给药 20只小鼠随机均分为对照组和丙泊酚组，对照组在小鼠外侧下丘脑微量注射0.9% NaCl 0.3 μL，参照文献[7-9]丙泊酚组在小鼠外侧下丘脑微量注射丙泊酚0.3 μL，微量给药速度为0.15 μL/min，给药后留针1 min。

1.2.3EEG与EMG数据采集和分析 小鼠手术后第7天开始采集数据，记录时室温保持22～23 ℃,6∶00-18∶00为光照时间，18∶00-次日6∶00为黑暗时间，小鼠自由由获得食物和水。待小鼠适应记录场景后，记录1 d的数据，评价EEG与EMG的质量以及小鼠睡眠/觉醒节律是否正常。待小鼠适应记录系统后，开始外侧下丘脑给药。为排除睡眠节律的影响，给药时间为18∶00，记录药后3 h(18∶00-21∶00)的数据用Neuroexplorer(5.0)软件分析，解析出EEG与EMG的对应关系，并经过人工核对，校正结果中不合理的判定。

1.2.4导管埋置位点检测 小鼠完成记录后，采用0.9% NaCl(37 ℃)和4%多聚甲醛(4 ℃)进行心脏灌注、立即取脑置4%多聚甲醛中定，随即转移至30%蔗糖和4%多聚甲醛溶液中脱水；待脑组织沉底后，冰冻切片，厚度为50 μm；按冠状面对外侧下丘脑连续切片，DAPI染色、封片，在荧光显微镜下观察导管埋置位点，导管埋置不准的动物不纳入统计。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 EEG与EMG监测判断小鼠脑功能状态

如图1所示，通过分析各组小鼠EEG与EMG，小鼠大脑EEG分为觉醒期、非快眼动睡眠(NREM)和快眼动睡眠(REM)，觉醒期EEG主要表现为高频、低幅度，此时较大幅度的EMG；NREM睡眠期EMG幅度较小，EEG；表现为低频、高幅度；REM睡眠期；EMG幅度较小，EEG出现特征性规律的θ振荡。见图1。

图1 EEG与EMG监测动物NREM睡眠、REM睡眠及觉醒状态结果Fig.1 Monitoring of NREM sleep, REM sleep and arousal status by EEG and EMG

2.2 丙泊酚对小鼠大脑觉醒时间、NREM和REM睡眠时间的影响

结果显示，外侧下丘脑微量注射丙泊酚后，与对照组比较，小鼠觉醒时间显著减少、NREM和REM睡眠时间显著增加，差异有统计学意义(P<0.001)，见图2；表明丙泊酚作用于小鼠外侧下丘脑可引起睡眠样行为，提示外侧下丘脑可能是丙泊酚发挥麻醉效应重要的靶区。

注：(1)与对照组比较，P<0.001。图2 丙泊酚作用外侧下丘脑对小鼠觉醒时间、NREM和REM睡眠时间的影响Fig.2 Effects of propofol on arousal time, NREM and REM sleep time in lateral hypothalamus of mice

注：(1)与对照组比较，P<0.001。图3 外侧下丘脑微注射丙泊酚后诱导出睡眠样EEG 能量谱Fig.3 Sleep-like EEG energy spectrum induced by microinjection of propofol into lateral inferior colliculus

2.3 外侧下丘脑微注射丙泊酚后诱导出睡眠样EEG 能量谱

EEG的能量谱可反映大脑功能状态。觉醒和警觉性高的时期，神经元兴奋性高、神经元集群电活动去同步化，表现出高频θ(4～10 Hz)振荡强，低频δ(0.5～4 Hz)振荡弱；相反，NREM睡眠期神经元兴奋性下降，出现高幅度同步化的δ振荡。如图3所示，外侧下丘脑微注射丙泊酚后可引起低频的δ振荡(0.5～2 Hz)显著增加(P<0.001)，与警觉密切相关的θ(4～10 Hz)振荡能量下降(P<0.001)，但不影响更高频的α(10～20 Hz)振荡能量。结果表明，外侧下丘脑微注射丙泊酚可降低皮层兴奋性、引起皮层神经元集群同步化活动、降低小鼠觉醒和警觉水平。

3 讨论

静脉注射丙泊酚导致觉醒和警觉水平下降，引起麻醉效应。目前，丙泊酚麻醉的神经机制尚不完全清楚。本研究发现在外侧下丘脑局部微注射丙泊酚，可引起睡眠样行为改变。通过EEG能量谱分析，发现丙泊酚引起EEG低频δ振荡能量增加，而减少脑电高频的θ振荡。上述结果表明，丙泊酚可直接作用于外侧下丘脑，降低皮层兴奋性、引起皮层神经元集群同步化活动、进而降低小鼠觉醒和警觉水平。该结果为丙泊酚产生麻醉效应提供了新的神经机理。

外侧下丘脑接受前额叶锥体神经元、背缝核五羟色胺能神经元、中脑多巴胺能神经元和基底前脑乙酰胆碱能神经元输入，广泛投射至前额叶、丘脑以及基底前脑[8,10]。大量文献报道，外侧下丘脑与觉醒与警觉程度高度相关。毁损或抑制外侧下丘脑可引起昏睡样行为表现，相反光/药物遗传激活外侧促觉醒神经元可快速诱导动物从睡眠向觉醒转换[8]。本研究发现外侧下丘脑微注射丙泊酚可使觉醒时间减少，EEG能谱出现睡眠样变化，该结果表明外侧下丘脑可能丙泊酚发挥麻醉作用重要的靶区。

在新皮层及皮层下海马区域，一方面丙泊酚直接作用于兴奋性神经元的胞体，增强钾通道或抑制超极化激活非选择性阳离子通道，使神经元发生超极化，引起兴奋性下调。另一方面，丙泊酚亦可增强抑制性输入，进而抑制这些脑区的兴奋性[7,9,11-13]。因此，推测丙泊酚也可通过上述的方式引起外侧下丘脑神经元兴奋性下降，进而促进睡眠样行为的发生，觉醒和警觉水平下降。

外侧下丘脑具有多种不同神经元类型，主要包括食欲素(Orexin)神经元、γ-氨基丁酸(GABA)神经元、谷氨酸能神经元以及黑色素聚集激素(MCH)神经元。近来，神经元特异性操控技术发现这些神经元具有不同功能，orexin神经元与GABA能神经元具有强烈的促觉醒作用，而MCH神经元则主要参与REM睡眠的发生[14]。本研究侧重于睡眠/觉醒行为学的观察，丙泊酚是否特异性抑制外侧下丘脑促觉醒神经元(orexin与GABA能神经元)及其分子机制尚不清楚，将来还需进一步研究。

综上，丙泊酚作为临床上常用的麻醉药物，具有起效迅速、残留少，但其关键性的作用机制并不清楚，并阻碍了选择性达到麻醉理想效应而较少产生呼吸与神经心理不良反应的新麻醉药的开发。本研究发现外侧下丘脑是丙泊酚发挥麻醉效应重要的靶区，该发现有望为理想麻醉药物的开发提供重要的理论依据。