山羊DQB1基因分析及其组织表达分析

郑 姚，王 利，李 娟，豆朋朋，魏 勇

(1.西南民族大学青藏高原研究院，四川成都610041；2.西南民族大学生命科学与技术学院，四川成都610041；3.四川畜牧科学研究院，四川成都610041)

山羊DQB1基因，即山羊主要组织相容性复合体II 类基因，属于山羊白细胞抗原基因之一，参与机体肽结合位点的合成[1-2]。其位于II 类基因的DQ亚区，编码β1 肽链，被命名为DQB1基因，主要负责将外源性抗原多肽片段运送至专门识别与Ⅱ类分子相结合的抗肽原CD4+T 淋巴细胞，引起免疫应答。近年来对DQB1基因的研究主要集中于人类疾病[3-4]。DQB1 基因能够显著地影响动物个体的抵御疾病能力[5-6]。由此可见，DQB1基因作为MHCⅡ类中的一员，在机体免疫反应中有着重要的作用。

金堂黑山羊是经自然选择和人为选育产生的四川省皮肉兼用型优良山羊品种。目前，国内外对于羊DQB1基因的研究主要涉及其遗传的多样性与免疫相关性。关于金堂黑山羊DQB1基因的相关研究还未见报道，本研究通过对金堂黑山羊DQB1基因序列进行克隆及生物信息学分析，采用荧光定量PCR 技术检测该基因的在各组织中的转录情况，为DQB1 功能的研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 主要实验材料 6 月龄健康金堂黑山羊，无菌采集其心脏、肺、脾、肌肉、肠组织，液氮速冻，-80 ℃冰箱中保存备用。RNAiso Plus、反转录试剂盒、TB GreenTMPremix ExTaqTMⅡ均购自宝生物工程(大连)有限公司；DL2000 DNA Marker、1.1×T3 Super PCR Mix 购自北京擎科新业生物技术有限公司。

1.2 引物设计 参照GenBank 中山羊DQB1基因序列(AY464653.1)，应用Primer Premier 5.0 软件设计引物(P1-F：5'-ATGTCTGGGATGCTGGC-3'/P1-R：5'-CGCACGAGCCCCTTCTG-3；P2-F：5'-GTGACCA TCTCCCCATCCA-3'/P2-R：5'-GTCCAGTCCCCGTTC CTAA-3')，参照山羊β-actin 管家基因(JX046106.1)设计内参引物(P3-F： 5'-CCGTGACATCAAGGAGAAGC-3'/P3-R： 5'-CCGTGTTGGCGTAAAGGT-3')。引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。P1 为PCR 引物，P2、P3 为荧光定量PCR 引物，预期扩增长度分别为785 bp、167 bp、266 bp。

1.3 金堂黑山羊DQB1基因PCR 扩增 采用RNAiso Plus 试剂对金堂黑山羊心脏、肺、脾、肌肉、肠5 种组织充分研磨处理，利用总RNA 提取试剂盒提取组织总RNA，利用反转录试剂盒合成cDNA。以肠组织cDNA 作为模板，采用P1 引物进行PCR 扩增，反应体系为25 μL，PCR 反应程序为：98 ℃2 min；98 ℃2 min 64.5 ℃10 s 72 ℃15 s，共39 个循环；72 ℃2 min。PCR 扩增产物经1 %琼脂糖凝胶电泳检测后，由生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序鉴定。

1.4 金堂黑山羊DQB1基因生物信息学分析 采用MegAlign DNAMAN ClustalX 和Mega5.0 等软件对DQB1基因进行同源性分析并绘制系统进化树。采用ExPASy 进行蛋白基本理化性质分析。采用SignalP4.0 TargetP SOPMA SMART SWISS MODEL预测蛋白信号肽剪切位点、亚细胞定位、二级结构、保守结构功能域及三级结构。

1.5 金堂黑山羊不同组织DQB1基因转录情况的检测 以β-actin 为内参基因，采用TB Green 荧光染料掺入法检测DQB1基因在金堂黑山羊心脏、肺、脾、肌肉、肠等5 种组织中的转录情况。反应体系为10 μL，P2 引物的检测反应程序：95 ℃3 min；95 ℃10 s、57.3 ℃20 s、72 ℃30 s，39 个循环；72 ℃2 min。P3 引物的检测反应程序：95 ℃3 min；95 ℃10 s、56.9 ℃20 s、72 ℃30 s，39 个循环；72 ℃2 min。采用2-△△Ct法分析结果，采用SPSS 24.0 单因素方差分析其显著性。

2 结果与讨论

2.1 金堂黑山羊DQB1基因PCR 扩增结果 以金堂黑山羊肠组织cDNA 为模板，采用P1 引物进行PCR 扩增，扩增得到DQB1基因片段(图1)。分析其开放阅读框为786 bp，可编码261 aa。序列提交至GenBank 获得登录号为MK294347。表明得到正确的DQB1基因。

2.2DQB1基因同源性分析 近年来，绵羊、牦牛等动物的DQB1基因均有报道[7-8]。本研究结果显示，金堂黑山羊DQB1基因与山羊、绵羊、牦牛、马、白尾鹿、野猪、家犬、人等DQB1基因同源性分别为95.2 %、94.1 %、91.3 %、89.6 %、87.6 %、87.3 %、85.6 %、85.5 %。系统进化树结果显示其与山羊聚为一类，亲缘关系最近，与绵羊亲缘关系次之，与家犬、人亲缘关系最远(图2)。同时发现金堂黑山羊与山羊DQB1基因编码的氨基酸序列(AAR97717.1)具有23 个差异位点。表明DQB1基因表现出高度保守性，同时保留一定种间特异性，这与有关学者研究结果一致[7,9-10]。

图1 金堂黑山羊DQB1 基因PCR 扩增结果Fig.1 Amplication of DQB1 gene in Jintang Black Goat by PCR

图2 DQB1 基因核苷酸系统进化树Fig.2 Phylogenetic tree of DQB1 gene

2.3 DQB1 蛋白相关结构预测 利用生物软件预测DQB1 蛋白分子量为29.97 ku，属于碱性亲水性蛋白。发现其在aa32～aa33 位有信号肽剪切位点，具有典型的MHC 分子结构，3 个结构域(MHC-Ⅱβ 结构域、IGc1 结构域、跨膜结构域)。表明该蛋白为分泌蛋白、跨膜蛋白。对该蛋白二、三级结构的预测结果与刘秀[9]、张晓芬[10]等研究结果基本一致，其主要以无规则卷曲、β- 折叠和α- 螺旋结构形式存在，表明DQB1 蛋白主要以此构成蛋白的特异功能部位。

2.4 金堂黑山羊不同组织DQB1基因转录情况检测DQB1基因组织转录水平的研究未见在山羊中研究报道，仅在藏绵羊、鱼类等有报道[9,11]。荧光定量PCR 检测结果显示，DQB1基因在金堂黑山羊心脏、脾、肌肉、肠、肺5 种组织中均有不同程度的转录。DQB1 基因在动物组织中分布广泛，且转录水平存在一定差异，由高到低依次为心脏、脾、肌肉、肠、肺，在心脏中转录水平显著高于其它组织(p＜0.01)(图3)。DQB1 位于抗原提呈细胞巨噬细胞表面，而心脏巨噬细胞可以通过膜蛋白参与心电传导而促进心跳[12]，表明DQB1基因可能间接参与心电传导的调节过程。该结果与目前已报道的其它物种相比存在差异，有学者[11]研究发现鱼类DQB1 基因在脾、肠中转录水平较高，心脏次之，在肌肉组织转录水平较低。表明DQB1 基因转录情况具有一定种间差异，另外可能由于实验动物生活于不同环境，受到诸多不可调控因素影响，进而影响DQB1基因转录情况。

图3 DQB1 基因在金堂黑山羊不同组织中的转录水平Fig.3 The levels of DQB1 mRNA transcription in different tissues of the goat

综上所述，本研究克隆了金堂黑山羊DQB1 基因，并对其进行了不同组织转录水平的分析，为进一步研究DQB1 功能及其作用机制提供参考。