可溶性fms样酪氨酸激酶-1荧光免疫层析法检测的临床性能评估

苏 倩，管世鹤，张 妤，周 强，范懿隽，付娟娟，傅柳陶，黄才敏，陆义红，张丽丽，张婉莹，储雯雯，韦 玉，吴园园

(安徽医科大学第二附属医院，安徽合肥 230601)

孕妇血清中的可溶性fms样酪氨酸激酶-1(sFlt-1)属于Ⅲ型受体酪氨酸激酶家族，分子量约为63.6kD[1]；由细胞外区1～6个免疫球蛋白样结构域构成，不含酪氨酸激酶域，编码区与fms样酪氨酸激酶-1(Flt-1)的胞外区完全一致，能与膜表面受体竞争结合血管内皮生长因子(VEGF)。最初于类脐静脉内细胞上被发现sFlt-1作为VEGF和胎盘生长因子(PLGF)的直接抑制物，血清水平升高则可导致胎盘滋养细胞及血管生长不良，从而导致内细胞损伤。sFlt-1主要通过与VEGF和PlGF结合，介导VEGF和PlGF的生物学功能，参与血管的形成、重塑和再植等作用。因而，sFlt-1与子痫前期的预测已成为研究焦点[2]。sFlt-1与PLGF是首个经过大规模临床试验验证的、可用于孕妇子痫前期预测及诊断的生化标志物[3]，血清sFlt-1与PLGF浓度的变化与孕妇罹患子痫前期的风险密切相关。目前，PLGF的检测已有酶联免疫吸附(ELISA)、时间分辨荧光免疫分析(TRFIA)、微流控(Microfluidics)、电化学发光法(ECL)[4-5]等报道；而sFlt-1的检测报道较少，主要是罗氏的电化学发光法。考虑到荧光免疫层析技术成本低，准确性高，操作简便、快速，可实现随到随诊，方便临床应用，具有较高的临床应用价值，本研究对荧光免疫层析法的sFlt-1检测试剂盒进行分析性能评价，以了解该试剂盒是否满足临床应用的需求。

1 资料与方法

1.1一般资料 收集2018年2-9月来本院就诊的孕妇(年龄：18～45岁、孕周：20～34+6周)，共152例；经检测血清sFlt-1浓度覆盖待评估试剂盒的线性区间40～85 000 pg/mL；按照罗氏电化学发光分析系统的检测结果，152例血清sFlt-1浓度分布为sFlt-1≤3 000 pg/mL共97例，>3 000 pg/mL共55例(3 000 pg/mL为20孕周以上的健康孕妇P95百分位数的参考值)。样本来自于临床常规检测剩余血清。

1.2仪器与试剂 罗氏全自动化学发光免疫分析仪(cobas6000 e601)及sFlt-1检测试剂盒(电化学发光法，批号：23042701)；荧光分析仪(广州蓝勃生物科技有限公司，AFS-1000)及sFlt-1检测试剂盒(荧光免疫层析法，批号：20170417-01)为江苏凯基生物技术股份有限公司产品，sFlt-1重组蛋白采购自无锡金泰格生物科技有限公司。

1.3方法 sFlt-1电化学发光法的检测，是基于钌(Ru)标记和磁微珠法的双抗体夹心的原理，检测试剂与样本中的sFlt-1蛋白形成 “抗体-抗原”复合物，施加电压后产生发光信号，采用电化学发光分析检测信号的强度，样本中的sFlt-1蛋白浓度成正相关。

sFlt-1荧光免疫层析法的检测，同样是基于双抗体夹心法的原理，将鼠抗人sFlt-1抗体作为标记抗体(用荧光微球标记)，另一鼠抗人sFlt-1F单克隆抗体划在载体膜(硝酸纤维素膜)作为检测线抗体，制备成检测卡；检测时，将80 μL样本加入检测卡中的样品孔中，样本中的sFlt-1蛋白首先与荧光微球标记的抗体结合，然后经过载体膜的层析泳动作用，再被检测线上的鼠抗人sFlt-1单克隆抗体吸附；加样15 min后通过荧光分析仪检测对应条带的荧光强度，结合标准曲线，计算出样本中sFlt-1的浓度。

参照美国临床实验室标准化委员会(CLSI)EP5-A、EP6-A、EP7-A、EP15-A文件[6-9]要求，以罗氏的sFlt-1电化学发光试剂盒的检测结果为准，对sFlt-1荧光免疫层析法检测试剂盒的分析性能进行评价，具体方法如下。

1.3.4回收实验 将高浓度的sFlt-1质控品A(10 μL)分别加入到基质B(100 μL)中，各测试1次，计算回收率R，应在85%～115%。

1.3.6方法学比对 采用罗氏的sFlt-1试剂盒作为比对的参比方法。本次临床性能评价共检测样本152例，样本类型为血清；同一份临床样本采用本项目待评价的荧光免疫层析检测试剂盒与参比方法平行试验；考察本项目待评价的荧光免疫层析检测试剂盒与参比方法的相关性R2，应不低于0.950。

以罗氏的sFlt-1试剂盒作为比对的参比，以3 000 pg/mL作为临界值，计算荧光免疫层析试剂盒的临床性能指标，包括相对灵敏度、相对特异性、总体符合率等。

2 结果

2.4回收实验 sFlt-1检测显示，原始浓度和检测浓度分别为93 540、8 617 pg/mL，计算得到sFlt-1荧光免疫层析法检测试剂盒的回收率为101.33%。据此确定sFlt-1荧光免疫层析法检测试剂盒的回收率在85%～115%的范围内。

2.5干扰物质 实验结果显示，血红蛋白等干扰物质在生理高浓度的情况下，对sFlt-1临床样本的干扰率均在-8%～8%的范围内，则认为血红蛋白等干扰物质在上述浓度条件下，对本研究的sFlt-1测定方法没有干扰作用，见表2。

表1 sFlt-1荧光免疫层析法检测试剂盒线性研究结果(pg/mL)

注：H为高值样本，L为低值样本

图1 sFlt-1荧光免疫层析法检测试剂盒的线性相关性

表5 干扰物质对检测结果的影响(ng/mL)

2.6方法学比对 方法学比对试验共检测了152例血清样本，荧光免疫层析法sFlt-1检测试剂盒每个样本测定值与相对应的罗氏电化学发光法sFlt-1检测试剂盒测定值作散点图，以荧光免疫层析法sFlt-1检测试剂盒(考核系统)作Y轴，罗氏电化学发光法sFlt-1检测试剂盒(参比系统)作X轴，见图2。线性回归方程：Y=1.023X-76.67，R2=0.970(>0.950)，斜率b=1.023，95%CI=-163.684～10.344；截距a=-76.67,95%CI=0.994～1.053；两个系统之间的相关系数r=0.985，表明两种检测方法一致性良好，差异有统计学意义(P<0.05)。

图2 sFlt-1回归分析

152例样本的测定值以3 000 pg/mL作为临界值进行定性分析，结果显示，荧光免疫层析法sFlt-1检测试剂盒相对于罗氏电化学发光法sFlt-1检测试剂盒的检测灵敏度为90.91%，相对特异性为100%，相对总体符合率为96.71%，见表6。

表6 以3 000 pg/mL为临界值对试剂盒检测结果的定性分析(n)

3 讨论

sFlt-1作为子痫前期发病机制、预测和诊断的重要生物标志物[10-13]，临床应用中一直缺乏合适的检测方法，目前仅有进口的试剂盒(瑞士罗氏的电化学发光法)；该试剂盒成本高，依赖大型分析设备，存在较大的普及困难。

荧光免疫层析技术是近年来兴起的一种快速免疫学检测方法[14-15]，灵敏度高，操作便捷，综合成本低，适合在临床科室进行现场检测，同时也是检验科的一种重要辅助技术手段，适用于检测量不大的项目，节省成本，提高工作效率。

本研究评估了基于荧光免疫层析技术建立的血清中sFlt-1的检测试剂盒，包括依据CLSI的EP5-A、EP6-A、EP7-A、EP15-A等规范性文件，对荧光免疫层析检测试剂盒的分析性能，包括：空白限、回收实验、线性范围、精密度和干扰试验，进行了验证：空白限≤12 pg/mL，而线性范围为40～85 000 pg/mL，两项技术参数达到了临床应用的要求；采用回收率作为回收实验评价的方法，经检测，回收率为101.33%；荧光免疫层析检测试剂盒的精密度(CV)：高值样本为3.63%，低值样本为5.92%，均符合荧光免疫层析检测试剂盒的技术要求；最后通过加入血红蛋白、类风湿因子等常见的干扰物质，证实在生理高浓度的情况下，不会对sFlt-1的检测结果造成干扰。最后，通过152例的临床样本，与罗氏的电化学发光法试剂盒进行对比研究，实验结果证实，本项目待评价的荧光免疫层析检测试剂盒与电化学发光法的符合率高，检测结果的相关性为0.985(>0.950)，证实本项目的sFlt-1荧光免疫层析检测试剂盒与电化学发光法试剂盒具有良好的一致性。

4 结论

本研究对基于荧光免疫层析技术的sFlt-1检测试剂盒的临床性能，如，精密度、线性范围、方法学比对等，进行了全面评估，证实其均能达到临床应用的需求，具有重要的临床意义。