长链非编码RNA FGF14-IT1在人胃癌组织和细胞中的表达及临床意义*

姚 林，谭 望，向万平，唐翎翰，肖江卫

(1.川北医学院附属医院胃肠外科/川北医学院肝胆胰肠疾病研究所，四川南充 637000；2.成都医学院第一附属医院胃肠外科，四川成都 610500)

胃癌是影响人类健康的一类重大疾病，是世界上第四大常见癌症和第二大癌症死因[1]。据统计，中国每年大约有679 100例新增胃癌患者，胃癌是中国人癌症死亡的第二大原因，在中国由于超过80%的胃癌患者都是在晚期被确诊，所以胃癌的5年生存率很低[2]。探明胃癌发生、发展及侵袭转移的分子机制，对提高胃癌疗效有着重要的意义，为胃癌患者个体化治疗方案的制订提供可能。在真核生物中，非编码RNA的数量非常多，远远超过了编码蛋白质的基因的数量。其中有很大比例的非编码RNA在RNA转录过程中长度超过200个核苷酸，这类RNA往往缺乏明显的开放阅读框，并且目前没有明显的证据证明他们具有编码蛋白质的功能，因此被定义为长链非编码RNA(lncRNA)[3-5]。研究发现，在胃癌的发生、发展过程中存在许多异常表达的lncRNA，它们与肿瘤的增殖、凋亡、侵袭、转移和不良的预后有着紧密的联系[6-9]。本研究探讨了课题组新发现的lnc RNA FGF14-IT1在胃癌组织和细胞中的表达差异，与临床病理特征的关系及临床价值。

1 资料与方法

1.1一般资料 收集2017年1月至2018年12月川北医学院附属医院胃肠外科83例胃癌患者胃癌组织及其配对的距离癌组织5 cm外的癌旁胃黏膜组织标本，术后都经病理检查证实。所有患者术前未进行放疗、化疗及其他抗肿瘤治疗。83例患者中男68例、女15例，男女比例为4.53∶1.00；发病年龄40～79岁，中位年龄63岁；肿瘤直径1～12 cm，平均直径(4.3±2.05)cm。术后病理TNM分期中Ⅰ期患者9例，Ⅱ期患者16例，Ⅲ期患者55例，Ⅳ期患者3例。采集标本前均经患者同意并签署知情同意书。组织标本取得后立即浸入液氮中迅速降温,随后放置于-80 ℃冰箱内保存。记录患者的临床及病理资料，包括性别、年龄、实验室检查、病史、临床分期和病理类型，并随访。

1.2仪器与试剂 4种胃癌细胞株AGS、MGC-803、BGC-823、SGC-7901及正常胃黏膜细胞(GES-1)均购自上海中科院细胞库。RNA提取试剂Trizol购自美国Invitrogen公司、cDNA合成试剂盒购自美国Promega公司、实时荧光定量聚合酶链反应(qPCR)试剂购自瑞士Roche公司。人FGF14-IT1引物及内参β-肌动蛋白(β-actin)引物均使用Primer Premier 6.0引物设计软件设计。FGF14-IT1引物，上游：5′-TGG GAA TTG CAA AGG CTT AC-3′，下游：5′-TGG ACA TCA GCT TGT TCT GG-3′。β-actin引物，上游：5′-GCA AGC AGG AGT ATG ACG AG-3′，下游：5′-CAA ATA AAG CCA TGC CAA TC-3′。

1.3方法

1.3.1细胞培养 将4种胃癌细胞株和正常胃黏膜细胞复苏在含有10%胎牛血清的培养基中，放于37 ℃、5%CO2、饱和湿度孵箱中培养，取对数生长期的细胞用于RNA的提取。

1.3.2RNA提取及qPCR 按Trizol说明书采用苯酚-氯仿抽提法，分别提取胃癌组织和细胞中总RNA，经紫外分光光度计检测，A260/A280在1.9～2.1视为提取的RNA的纯度很高。cDNA第一链合成：核糖核酸酶抑制剂 1 μL，5×反应缓冲液5 μL，四种脱氧核苷酸单体(dNTPs) 1.25 μL，反转录酶 1 μL，MgCl2 4 μL,Oligo(dT)15 Primer 1 μL,Random Primer 1 μL,无核酸酶的双蒸水至总体积25 μL。其余步骤按照说明书进行。定量PCR实验及结果分析：qPCR采用2×SYBR Green Master Mix，采用20 μL体系，其中cDNA1.5 μL，正向引物0.4 μL，反向引物0.4 μL，2×SYBR Green Master Mix 10 μL，无核酸酶的双蒸水7.7 μL。PCR反应条件：95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，70 ℃ 30 s扩增45个循环。以β-actin为内参照。结果分析采用经典的2-△△Ct法进行基因表达的相对定量[10]。目的基因Ct值用内参基因来进行统一标准化(△Ct=Ct目的-Ct内参)。

2 结果

2.1lncRNA FGF14-IT1在胃癌组织和细胞中的表达水平 36.14%(30/83)的胃癌组织FGF14-IT1表达水平高于癌旁组织，63.86%(53/83)的胃癌组织FGF14-IT1表达水平低于癌旁组织。在整体水平上，FGF14-IT1在癌组织中的相对表达量为1.630±1.896，明显低于癌旁组织的2.257±2.599，差异有统计学意义(t=2.108，P=0.038)。胃癌细胞株AGS、MGC-803、SGC-7901中FGF14-IT1的相对表达量较正常胃黏膜细胞GES-1明显降低(P<0.001)，见图1。

注：A为83例胃癌组织中lncRNA FGF14-IT1高表达与低表达情况；B 为lncRNA FGF14-IT1在胃癌组织及癌旁组织中的表达水平；C为各细胞株中FGF14-IT1的相对表达水平，此结果来自3次独立实验结果，*表示与GES-1比较，P<0.05

2.2lncRNA FGF14-IT1与临床病理特征的关系 根据胃癌组织与其对应的癌旁组织中lncRNA FGF14-IT1的表达水平的高低，将癌组织中表达量高于对应癌旁组织的病例纳入高表达组(30例)，在癌组织中表达量低于对应癌旁组织的病例纳入低表达组(53例)。用χ2检验分析发现，表达水平的高低与患者浸润深度、淋巴结转移、TNM分期显著相关，而与性别、年龄、吸烟、饮酒、肿瘤直径、分化程度、远处转移、脉管浸润、神经浸润、肝脏转移、腹水、脂肪结节转移无明显相关性，见表1。

表1 FGF14-IT1表达水平与胃癌患者临床资料的相关性分析(n)

续表1 FGF14-IT1表达水平与胃癌患者临床资料的相关性分析(n)

2.3lncRNA FGF14-IT1与胃癌转移的关系 将淋巴结转移阳性患者定义为胃癌转移阳性，没有淋巴结转移者定义为胃癌转移阴性。单因素logistic回归分析发现，FGF14-IT1、肿瘤大小、分化程度、浸润深度与胃癌转移有关联；多因素分析发现，胃癌转移与FGF14-IT1、浸润深度有关联，见表2。

表2 单因素和多因素分析影响胃癌患者肿瘤转移的因素

注：OR为比值比;CI为置信区间；-表示该项无数据

3 讨论

胃癌早期症状不明显，多数人在确诊时已经处于进展期，所以预后不良[11]。因此早期检测胃癌，有效地预测治疗前后的效果，开发新的治疗方案是改善胃癌预后的有效策略，找到一个理想的特异性肿瘤标志物对于提高胃癌的早期诊断率至关重要。lncRNA具有丰富的生物学功能，它主要从表观遗传水平、转录水平、转录后水平这三个层面对基因表达进行调控，其中转录前水平主要通过DNA甲基化与去甲基化、组蛋白修饰等进行调控；转录水平的调控主要通过对启动子、增强子的调节来影响基因的表达；转录后水平的调控主要是对mRNA剪接、编辑及降解等转录后加工修饰过程的调节[12-14]。近年来，随着对lncRNA研究的深入，已经发现一些在胃癌中异常表达的lncRNA可以作为胃癌的肿瘤生物标志物,并且有助于胃癌预后的判断。例如，ZHOU等[15]发现血浆中的H19可以作为生物标记物用于早期胃癌患者的筛查，并且可以作为胃癌患者术后的一个动态监测指标。SUN等[16]发现在胃癌组织中低表达的母系印记基因(MEG3)与肿瘤大小有关，下调MEG3的表达水平会促进胃癌细胞增殖，并能作为胃癌不良预后的生物标志物。SHAO等[17]发现lncRNA-RMRP可以吸附miR-206，调控细胞周期蛋白D2的表达，并且可以作为一个肿瘤标志物预示着不良的预后。

本研究前期通过基因芯片首次发现FGF14-IT1在胃癌组织中低表达，通过检测83例胃癌及相应癌旁组织中FGF14-IT1的表达发现，与配对的癌旁组织比较，FGF14-IT1在53例胃癌组织中低表达，而在30例胃癌组织中高表达，在整体水平上， FGF14-IT1在胃癌组织中呈明显低表达。笔者推测由于肿瘤的异质性，不同的胃癌细胞株具有不同的生物学特性及不同表型，所以在不同的胃癌患者及胃癌细胞株中，FGF14-IT1的调控机制可能存在差异，导致了一部分患者高表达，一部分患者低表达，但具体原因仍需进一步的探索。分析FGF14-IT1的表达与临床病理特征之间的关系，发现FGF14-IT1与患者浸润深度、淋巴结转移、TNM分期显著相关。因此推测FGF14-IT1可能参与了胃癌的发生发展过程，尤其是在侵袭转移方面，为下一步的分子机制的探索提供了一个方向。此外通过回归分析也发现异常表达的FGF14-IT1与胃癌转移有关联。虽然FGF14-IT1在胃癌中的调控机制目前尚不明确，但进一步的探索其机制，FGF14-IT1有望成为胃癌基因诊断和治疗的重要靶点及用于评估胃癌患者预后的生物标志物。

4 结论

胃癌患者组织和细胞中FGF14-IT1的表达水平明显降低，并且与患者发生淋巴结转移、肿瘤浸润、TNM高分期相关，可能是影响胃癌患者肿瘤转移的独立风险因素。本研究胃癌组织标本数量有限，组织中FGF14-IT1水平对胃癌是否具有诊断价值仍有很多工作需要完成，但随着对FGF14-IT1在胃癌中的调控机制的进一步研究，FGF14-IT1在胃癌诊断方面可能展现出广阔的临床应用前景。