高效液相色谱法对白酒中的L-乳酸和D-乳酸的手性分离和测定

江 锋，赵振宇，聂 叶，李清亮，刘 松，王和玉

（贵州茅台酒股份有限公司，贵州仁怀 564501）

乳酸（Lactic acid）学名2-羟基丙酸，结构式为CH3CHOHCOOH，相对分子质量为90.08，由于分子内含有一个不对称碳原子，因此具有旋光异构现象[1]，可区分为L-乳酸和D-乳酸，当两者以等比例混合时，即成为内消旋的DL-乳酸。

目前，分离和测定L-乳酸与D-乳酸手性对映体的方法主要包括酶法[2]、气相色谱(GC)[3]、气质联用(GC-MS)[4]、毛细管电泳(CE)[5]、液质联用(LCMS)[6]、手性高效液相色谱法(HPLC)[7]以及柱前衍生将手性对映体改变成非手性物质再用HPLC 测定的方法[8]。不同的方法都有局限性，如酶法测定步骤多，酶易失活，测定误差大；EDTA 定钙法测量误差大，对乳酸的两种对映体无法精确定量，如果采用普通的有机酸色谱柱，是无法区分乳酸的两种对映体的。

自然界中天然的乳酸是L-乳酸，D-乳酸主要通过合成产生。D-乳酸的合成方法可以分为化学合成法、酶法和微生物发酵法。乳酸是白酒中重要的有机酸，其含量的多少对白酒的口味和后味有较大影响，国内暂无白酒中乳酸构型的文献报道。因此，建立能快速、灵敏和高效拆分检测白酒中两种乳酸对映异构体的方法非常必要。

本研究利用手性色谱柱中青霉胺与二价铜离子配位体，对乳酸的两种对映体的络合能力的不同[9]，将L-乳酸和D-乳酸进行拆分并定量，研究了该法对于乳酸标准品和酒样样品的乳酸检测重现性，还研究了在白酒中添加L-乳酸和D-乳酸标准品后的检测回收率，最后用该法检测了20 种市售白酒中的L-乳酸和D-乳酸含量。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂及仪器

样品：白酒，包括浓香型、酱香型、清香型等市售的白酒20种。

试剂：L-乳酸，色谱纯，98%纯度，Sigma-Aldrich 公司出品；D-乳酸，色谱纯，93%纯度，Sigma-Aldrich 公司出品；异丙醇，天津市科密欧化学试剂开发中心。

仪器设备：超高效液相色谱仪(Agilent 1260 Series)带二极管阵列检测器、手性柱Chirex 3126(D)-penicillami（4.6 mm i.d×250 mm L,5 μm）（美国菲罗门）、分析天平（METTLER TOLEDO XP205）、纯水仪（艾科浦RM-220）；Talboys 数显型多管式旋涡混合器（美国）；KQ-500DA 昆山超声仪器（昆山舒美）；BLC-1玻璃砂芯过滤装置，0.45 μm滤膜（安捷伦，再生纤维素滤膜）。

1.2 试验方法

1.2.1 样品前处理

取1 mL 酒样置于10 mL 离心管中，加入4 mL超纯水，旋涡振荡混匀，经水系0.22 μ m 的微孔滤膜过滤后用于液相色谱测定。

1.2.2 色谱条件

流动相：2 mmol/L 的5%异丙醇流动相溶液配制，称取CuSO4·5H2O 0.500 g，加入50 mL双蒸水溶解，转移至100 mL 的容量瓶中，加入50 mL 的色谱纯异丙醇，再用双蒸水定容至1000 mL，用0.45 μ m孔径的合成纤维素滤膜进行真空超滤，超声波脱气；流动相流速为1 mL/min；柱温30 ℃；二极管阵列检测器，检测波长为254 nm；标准品和样品溶液用前均经过0.22 μm滤膜过滤；进样量为5 μL。

1.2.3 标准曲线的制作

分别准确称取一定量的L-乳酸、D-乳酸标准品，用超纯水溶解并定容于100 mL 容量瓶中，配成L-乳酸、D-乳酸标准液，然后进行稀释，分别配成0.020mg/mL、0.050mg/mL、0.100mg/mL、0.200mg/mL、0.400 mg/mL、0.600 mg/mL、0.800 mg/mL 的标准溶液。上机前经0.22 μ m的微孔滤膜过滤。

1.2.4 定性与定量

将相同色谱条件下的样品色谱图与乳酸标准液色谱图进行对照，根据保留时间确定样品中的L-乳酸、D-乳酸。用外标法定量，计算出样品中L-乳酸和D-乳酸的含量。

1.2.5 精密度试验

取一定浓度的L-乳酸、D-乳酸标准品溶液，连续进样6 次，观察L-乳酸和D-乳酸的保留时间及峰面积，计算RSD值。

1.2.6 重现性试验

取同一个酒样6 份，观察保留时间和峰面积，计算保留时间和峰面积的RSD值。

1.2.7 回收率试验

分别向已知L-乳酸、D-乳酸浓度的酒样中加入3 种浓度的L-乳酸、D-乳酸标准品溶液，取5 μL注入液相色谱仪，重复进样3 次，观察保留时间和分析含量，计算保留时间的RSD 值和含量的回收率。

2 结果与讨论

2.1 手性柱HPLC 法对乳酸标准品与白酒中乳酸的手性拆分和检测

乳酸2种对映体手性拆分HPLC图谱见图1。

图1 乳酸2种对映体手性拆分HPLC图谱

由图1可知，乳酸对映体L-乳酸的出峰时间约为13.0 min，D-乳酸的出峰时间约为16.0 min，根据乳酸标准品的浓度和峰面积，得L-乳酸标准曲线方程为Y=2.05X+0.673，回归系数R2=0.999；D-乳酸的标准曲线方程为Y=1.633X+0.86，回归系数R2=0.999。式中X 为乳酸浓度（g/L），Y 为乳酸的峰面积。

根据标准曲线方程和图1 的出峰时间与峰面积，可计算L-乳酸和D-乳酸的含量，可知该白酒酒样中以D-乳酸为主，D-乳酸的含量占乳酸总量的86%以上。本研究利用手性柱Chirex 3126 检测L-乳酸和D-乳酸，Chirex 3126 是一种配体交换柱，以固相化与过渡金属离子（Cu2+）配位的配体为固定相，基于流动相中的配体与固定相的配体间交换平衡以及稳定性来分离L-乳酸和D-乳酸[9]。

2.2 精密度试验

对待测L-乳酸、D-乳酸标准品平行测定6 次，结果表明精密度满足分析要求，其结果见表1。

2.3 重复性试验

取酒样1样品，连续取6份，测定L-乳酸、D-乳酸的含量，其结果见表2。

2.4 回收率试验

为了考察测定结果的准确性，进行了回收率的测定，结果见表3。可以看出，L-乳酸的回收率分别为98.47%、100.75%、100.71%，RSD 分别为0.13%、0.59%、0.75%；D-乳酸的回收率分别为107.88%、105.65%、100.1%，RSD 分别为0、0.75%、1.17%。回收率在98.47%～107.88%之间，RSD小于2%，说明该方法测定结果比较可靠。

表1 精密度试验

表2 重复性试验

表3 回收率试验

2.5 最低检出限的测定

用L-乳酸、D-乳酸标准溶液进行逐步稀释后，进行HPLC 分析，以3 倍信噪比计算最低检出限为5 mg/L。

2.6 利用手性柱HPLC 法检测白酒产品中L-乳酸和D-乳酸的含量

利用手性柱HPLC 方法测得白酒样品JY1—JY20 中L-乳酸和D-乳酸含量，酒样包括浓香型、酱香型、清香型等市售的白酒。白酒中L-乳酸和D-乳酸的含量见表4。

结果表明，大部分酒样里D-乳酸明显高于L-乳酸，只有JY10、JY13、JY16 的L-乳酸与D-乳酸含量相近。

3 结论

采用高效液相法和手性柱可以将白酒中的L-乳酸和D-乳酸分开，L-乳酸和D-乳酸的标准曲线在0.020～0.800 g/L 范围线性良好，两者的线性相关系数都为0.999。白酒中L-乳酸和D-乳酸的回收率分别是98.47%～100.75%和100.10%～107.88%。该方法操作简便，精密度和准确度高，适用于白酒中L-乳酸和D-乳酸的测定。

表4 20种市售白酒的L-乳酸和D-乳酸含量