金花葵花总黄酮的微胶囊条件优化及其对冷鲜肉保鲜作用的研究

王菲，于苏琦，宋力，侯雨歌

(辽宁石油化工大学 化学化工与环境学部，辽宁 抚顺 113001)

金花葵花黄酮是一种安全、无毒、易制备的生物活性物质，具有较好的抗氧化和抗菌等活性[1]。但若直接作为生物保鲜剂使用，其稳定性稍差，且保鲜时间较短，实际应用受到极大限制。

冷鲜肉含丰富营养，但冷鲜肉如何保鲜成为业界面临的难题[2]。冷鲜肉富有水分，长时间、无任何措施的放置会出现干瘪、腐烂等状况，造成严重浪费。通过微胶囊技术可以在一定程度上保护活性物质不受外界不良因素(如光、热等)的影响[3-4]，稳定性高、缓释性好、产率高、保鲜效果理想，可控制水分流失，抑制微生物生长与繁殖，延缓冷鲜肉发生腐败变质。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

金花葵花，由辽宁恒生实业集团有限公司提供；新鲜猪后腿肉，市售；芦丁标准品，色谱纯；无水乙醇、盐酸、硝酸铝、氢氧化钠、亚硝酸钠、氯化钠、硼酸、氧化镁、溴甲酚绿、甲基红、壳聚糖均为分析纯；安琪酵母，购自超市；酵母提取物、葡萄糖、蛋白胨、琼脂粉均为生物试剂；去离子水，实验室自制。

AR124CN电子天平；ALC-1100.2电子天平；UV-2600可见分光光度计；LGJ-10型冷冻干燥机；RE-52AA型旋转蒸发器；SHB-Ⅲ型循环水式多用真空泵。

1.2 金花葵花黄酮酵母微胶囊制备

1.2.1 金花葵花总黄酮的提取 准确称取一定量金花葵花粉末，按料液比1∶30 g/mL加入体积分数75%的乙醇溶液，在60 ℃水浴提取2.5 h，离心，取上清液，浓缩，冷冻干燥后备用。

1.2.2 酵母细胞制备 称取一定量安琪干酵母，按1∶20 g/mL加入质量分数5% NaCl，在54 ℃水浴振荡5 h，离心后水洗2次。冷冻干燥，得到酵母细胞。

1.2.3 金花葵花总黄酮酵母微胶囊制备 称取一定量酵母细胞，加入10 mL金花葵花总黄酮浓缩液，水浴振荡6 h，离心，水洗3次。冷冻干燥，得到金花葵花总黄酮酵母微胶囊[5]。

1.3 保鲜冷鲜肉

1.3.1 冷鲜肉的处理 在进行实验之前，先用75%酒精进行相应实验用具的消毒灭菌工作，再经20 min紫外照射灭菌处理。在无菌操作下，清理掉猪后腿冷鲜肉的筋、膜及脂肪，切成140 g/块。实验分为4个实验组，即空白组、2%黄酮粗提液组、2%黄酮酵母微胶囊组(以黄酮含量计)和2%壳聚糖组。在这3种不同保鲜液中进行浸泡30 min，夹出并晾干，置于自封袋中排气封口。与空白组一同放入4 ℃冰箱冷藏[6]。于第0，1，3，5，7，9 d取出，测定并计算各实验组中相关的微生物指标和理化指标。

1.3.2 测定指标

1.3.2.1 汁液损失率 原料肉中汁液损失的质量占原料肉的质量百分比即为汁液损失率。实验当天称取每块冷鲜肉初始质量(M)和托盘质量(m)。于第1，3，5，7，9 d取出肉样，将汁液倒尽，沥干水分，再次称取肉块与托盘的总质量(W)，计算各实验组的汁液损失率(X，%)。

1.3.2.2 挥发性盐基氮(TVB-N) 参照GB/T 5009.228—2016，从各实验组称取10.00 g肉样，剪碎，放在三角瓶中，加入100 mL水，摇匀，浸泡0.5 h，过滤，留滤液。实验时，事先在三角瓶中装好已加入5～6滴混合指示液的2%硼酸吸收液10 mL，注意将蒸馏器的冷凝管下部插至三角瓶内液面下，以防漏气。准确吸取各实验组样品滤液10 mL，加入蒸馏器反应室中，加入5 mL质量分数 1% MgO混悬液，立即盖塞，做好水封。通入加热蒸汽发生器，当蒸馏装置中充满蒸汽时，立即关闭蒸汽出口管，从第1滴冷凝水产生时开始计时，5 min后停止蒸馏。移走吸收液，用0.01 mol/L HCl标准溶液进行滴定，滴定终点为蓝紫色[7]。同时做试剂空白。

1.3.2.3 pH值 从各实验组称取10.00 g样品，剪碎，加入蒸馏水90 mL，振荡0.5 h，过滤、取滤液，测定各实验组的pH值。

1.3.2.4 菌落总数 参照GB 4789.2—2010，在无菌条件下，从各实验组称取10.00 g样品，剪碎，置于事先盛有90 mL 0.85%无菌生理盐水的三角瓶中，封口，于摇床中充分振摇3 min。吸取1 mL上清液，并进行10倍递增稀释，从中挑选适当稀释度的样液倒入，再慢慢倒入PCA培养基，于37 ℃恒温培养，于第1，3，5，7，9 d对各实验组分别进行菌落总数的计数[7]。

2 结果与讨论

2.1 金花葵花总黄酮微胶囊制备条件优化

主要考察芯壁比(黄酮含量与预处理酵母细胞质量之比)、振荡温度和振荡时间对金花葵花总黄酮微胶囊包埋效果(包埋率)的影响。

2.1.1 芯壁比对包埋率的影响 称取一定量预处理过的酵母细胞6份，分别按芯壁比4∶1，2∶1，1∶1，1∶2，1∶3，1∶4加入10 mL总黄酮浓缩液，于60 ℃下恒温水浴中振荡6 h，离心、冷冻干燥，计算各实验组的包埋率，结果见图1。

图1 芯壁比对包埋率的影响Fig.1 Effect of core wall

由图1可知，芯壁比增大时，包埋率先缓慢增长，随后快速上升，芯壁比1∶3时包埋率达到最大，随后包埋率逐渐减小。这是因为酵母细胞对黄酮的包埋有一定的承载能力，因此随芯壁比增加，酵母细胞对黄酮的包埋能力逐渐增强，而当芯壁比达到 1∶3 时，酵母细胞对黄酮的包埋能力已经饱和，若再继续增加壁材用量，会出现包埋量超载的问题，影响包埋率[6]。

2.1.2 振荡温度对包埋率的影响 称取一定量预处理过的酵母细胞5份，各按芯壁比1∶1加入10 mL总黄酮浓缩液，分别在30，40，50，60，70 ℃的恒温水浴振荡6 h，离心、冷冻干燥，计算各实验组的包埋率，结果见图2。

图2 振荡温度对包埋率的影响Fig.2 Effect of vibration temperature

由图2可知，随着振荡温度增加，包埋率先增大后逐渐减小。振荡温度为40 ℃时包埋率最大。主要是由于在一定振荡温度范围内，温度逐渐升高时，黄酮分子热运动加剧，有助于酵母细胞包埋黄酮。但当温度>40 ℃时，分子热运动过于剧烈，反而破坏包埋效果，包埋率显著减小[8]。故振荡的适宜温度为40 ℃。

2.1.3 振荡时间对包埋率的影响 称取一定量预处理过的酵母细胞5份，各按芯壁比1∶1加入10 mL总黄酮浓缩液，于60 ℃水浴中分别振荡2，4，6，8，10 h后，离心、冷冻干燥，计算各实验组的包埋率，结果见图3。

图3 振荡时间对包埋率的影响Fig.3 Effect of vibration time

由图3可知，随振荡时间延长，包埋率先增大后逐渐减小，在振荡7 h时包埋率达到最大值。这是因为酵母细胞主要是借助由细胞内外浓度差而产生的扩散作用进行黄酮包埋[9]。振荡初期，随着时间延长，黄酮的扩散作用加快，被酵母细胞很好地包埋，包埋率不断增大。但继续增加振荡时间，反而导致已经被包埋的黄酮从酵母细胞中扩散出来，使得包埋率骤降。故振荡时间宜为7 h。

2.1.4 正交实验 根据单因素的实验结果，考察芯壁比、振荡温度和振荡时间对微胶囊包埋率的影响，确定制备金花葵花总黄酮微胶囊化最适条件。实验结果见表1，方差分析见表2。

表1 正交实验结果Table 1 The resalt of orthogonal test

表2 方差分析结果Table 2 The result of variance analysis

由表1可知，最佳因素水平组合为A2B2C1，即芯壁比为1∶3，振荡温度为30 ℃，振荡时间为7 h。按此条件进行3组平行验证实验，测得包埋率分别为55.16%，50.33%，56.09%，平均包埋率为53.86%，大于表1中所有实验组的最大包埋值(52.3%)，故此因素水平组合即为金花葵花总黄酮酵母微胶囊化的最适条件。将3组验证实验所制备的微胶囊进行混合，测定并计算得到其中黄酮含量为55.19 mg/g。

由表1可知，各因素对包埋效果的影响程度为：A>C>B，即芯壁比>振荡温度>振荡时间，其中，芯壁比对包埋率影响最大。

对于表2，查F分布临界表，F0.01(2，2)=99，F0.05(2，2)=19，F0.1(2，2)=9；当F(2，2)>F0.01(2，2)时显著记为**，当F(2，2)值介于F0.05(2，2)～F0.01(2，2)之间时显著记为*，当F(2，2)

2.2 冷鲜肉保鲜效果

2.2.1 汁液损失率 在实际的加工生产和贮存中，冷鲜肉常常会发生挥发、汁液流失等现象，会严重影响其营养价值、感官价值和销售价值，故可用汁液损失率来衡量肉质持水力[10]。各实验组中汁液损失率见图4。

图4 各实验组中汁液损失率的变化Fig.4 Changes of the juice loss rate in each experimental group

由图4可知，冷鲜肉保藏时间越长，其汁液损失率越大。在整个实验过程中，黄酮粗提液组汁液损失率变化幅度最大，酵母微胶囊组和空白组次之，而壳聚糖组汁液损失率变化幅度最小。在实验的前5 d 里，酵母微胶囊组的汁液损失率变化最小，这是因为实验初期，即前5 d的时间里，微胶囊组冷鲜肉的表面黄酮浓度较低，故与黄酮粗提液组相比，渗透到肉内部的黄酮量更少，故持水力与空白组接近，且好于黄酮粗提液组；但随保存时间延长，第5 d以后，微胶囊组中的黄酮不断被释放出来，造成冷鲜肉表面不断渗透进黄酮，形成浓度差，从而导致冷鲜肉失水加剧。综上分析可知，酵母微胶囊及壳聚糖都有一定的持水作用。

2.2.2 挥发性盐基氮(TVB-N) 由于冷鲜肉自身含有酶类及微生物，此外还受到来自于环境中微生物的污染，故在贮存期间，其所含蛋白质会被酶及微生物分解，从而产生具有挥发性的碱性含氮物质，如氨及胺类等。变质肉中挥发性盐基氮含量高(TVB-N)，大于20 mg/100 g[5]。不同实验组的TVB-N含量见图5。

由图5可知，不同实验组的TVB-N含量不同，但变化规律一致。酵母微胶囊处理、黄酮粗提液组以及壳聚糖组在第9 d时，其所含TVB-N含量均低于20 mg/100 g，均未超标。但空白组TVB-N含量一直高于其他三组，且在第7 d时数值高于20 mg/100 g，说明此时肉质已经变质。结果表明，酵母微胶囊组TVB-N明显小于空白组，其能有效抑制微生物的生长繁殖，延长货架期。

图5 各实验组中挥发性盐基氮的变化Fig.5 Changes of TVB-N in each experimental group

2.2.3 pH值 冷鲜肉在贮存过程中pH值会逐渐增大，肉质变差，这主要是因为冷鲜肉中蛋白质会被其所含酶和微生物分解而产生氨及胺类等碱性化合物[10]。各实验组中冷鲜肉pH值见图6。

图6 各实验组中pH的变化Fig.6 Changes of pH in each experimental group

由图6可知，各实验组中冷鲜肉pH值均随时间延长而不断增大，但增长幅度各不相同，即黄酮粗提液组<壳聚糖组<酵母微胶囊组<空白组，即黄酮粗提液组能较好地抑制pH增长。这是黄酮粗提液组中黄酮含量很高，能效抑制微生物生长，延缓蛋白质分解，使pH保持较低值。壳聚糖组中壳聚糖具有成膜性，能减小肉质与氧气的接触，抑制微生物生长繁殖以及对蛋白质的分解作用。酵母微胶囊组pH值比前两组稍高一些，主要是由于酵母微胶囊组具有缓慢释放黄酮的作用，开始几天黄酮浓度较低，抑菌作用较弱，随时间延长，大量黄酮被释放出来，有效抑制微生物的生长，故第7 d以后，pH值激增的趋势被抑制。综上可知，3种保鲜液对冷鲜肉均具有一定的保鲜作用。

2.2.4 菌落总数 随保存时间延长，冷鲜肉中的菌落总数逐渐增多，当达到6 lgcfu/g时，说明肉已经腐败变质[3]。指标的评价标准为：一级鲜肉菌落总数≤104cfu/g；二级鲜肉104cfu/g<菌落总数≤106cfu/g；腐败肉菌落总数>106cfu/g[10-11]。各实验组冷鲜肉中的菌落总数见图7。

图7 各实验组中菌落总数的变化Fig.7 Changes of colonies number in each experimental group

由图7可知，各实验组中保鲜剂的抑菌性能力不同，即酵母微胶囊组>壳聚糖组>黄酮粗提液组>空白组。经过不同保鲜液处理的实验组，其菌落总数均明显低于空白组。且空白组在第9 d时菌落总数为8.15 lgcfu/g，已达到腐败肉的标准。而另外三组在实验的9 d内，仍处于二级鲜肉标准。其中，酵母微胶囊组表现的抑菌性最佳，这是由于黄酮较好的抑菌性以及微胶囊的缓释作用而实现的，且在第9 d时菌落总数为6.51 lgcfu/g，为所有实验组中的最低值。表明酵母微胶囊组具有较好的抑菌效果。

3 结论

(1)金花葵花总黄酮的酵母微胶囊化最适条件：芯壁比1∶3，振荡温度30 ℃，振荡时间7 h，此时微胶囊包埋率可达53.86%。

(2)与空白组相比，各保鲜液对冷鲜肉都有一定保鲜作用，酵母微胶囊与壳聚糖的保鲜效果十分接近。金花葵花总黄酮酵母微胶囊在汁液损失率、挥发性盐基氮和菌落总数实验中均表现出了较好的保鲜，可保鲜9 d左右。