益肾补气强身茶对免疫抑制小鼠的免疫调节作用及机制研究

罗伦才 罗丹 童妍

615000凉山彝族自治州第二人民医院1，四川 西昌

610031西南交通大学生命科学与工程学院2，四川 成都

益肾补气强身茶属新型中药复方制剂，具有安养五脏、润燥通便、降脂通脉功能。研究证实[1-3]，益肾补气强身茶中黄精多糖、黄芪总黄酮能有效逆转或修复环磷酰胺(CTX)所致免疫抑制模型小鼠的免疫功能。天然中草药具有一定的调节免疫功能，且毒副作用少。本文主要探讨益肾补气强身茶对于免疫抑制小鼠是否有免疫调节作用。

资料与方法

试验药物：益肾补气强身茶；CTX。

动物：KM 小鼠，雌雄各半，60只，体重18～22 g，合格证号：SCXK(川)2013-24。

试剂：考马斯亮兰(A045-2)、酸性磷酸酶(ACP)测试盒(A060-1)、乳酸脱氢酶(LDH)测试盒(A020-1)；1640 培养基(SH30809.01)、胰酶(J150031)；二甲基亚砜(D-5879)、 LPS(L2880)、 刀 豆 蛋 白A(ConA)(C2272)、中性红溶液(N6264)。

仪器：722可见分光光度计；手提式不锈钢压力蒸汽灭菌器。

方法：小鼠随机分为6 组，空白组、模型组、阳性组及益肾补气强身茶高、中、低剂量组，每组10 只。除空白组外，其余组给药隔天进行皮下注射CTX 30 mg/kg 建立免疫功能低下小鼠模型；阳性组左旋咪唑25 mg/kg，益肾补气强身茶高、中、低剂量组(5.08 g/kg、2.54 g/kg、1.27 g/kg)，空白组和模型组给予等体积蒸馏水，连续灌胃10 d。

观察指标：①胸腺、脾脏指数测定，分别取胸腺、脾脏称量湿重。②LDH 和ACP 活性测定，按试剂盒说明进行测定。③按常规方法制备小鼠脾细胞悬液，然后使用四甲基偶氮唑盐法测定ConA 诱导的小鼠脾脏T 淋巴细胞增殖反应[4]。使用MTT法对自然杀伤细胞(NK细胞)和淋巴因子激活的杀伤细胞(LAK 细胞)活性进行测定。④按常规方法制备腹腔巨噬细胞，检测巨噬细胞吞噬中性红能力。

统计学方法：采用SPSS 16.0 软件分析数据。计量资料用(±s)表示，采用t检验；计数资料用[n(%)]表示，采用χ2检验；P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

对免疫抑制小鼠免疫器官、ACP 和LDH 活性的影响：胸腺、脾脏指数测定显示，各组胸腺、脾脏指数比较，差异无统计学意义(P＞0.05)，见表1和表2。

ACP 活性测定：与空白组比较，模型组小鼠脾脏样本中ACP 活性降低，差异有统计学意义(P＜0.05)；与模型组比较，阳性药组、中剂量组ACP 活性升高，差异有统计学意义(P＜0.05)，见表3。

LDH统计结果：与空白组比较，模型组小鼠脾脏样本中LDH活性降低，差异有统计学意义(P＜0.05)；与模型组相比，阳性药组、中剂量组LDH 活性升高，差异有统计学意义(P＜0.05)，见表4。

对免疫抑制小鼠免疫细胞的影响：ConA 诱导的小鼠脾脏T 淋巴细胞增殖反应：与空白组比较，模型组的ConA诱导的T淋巴细胞增殖减少，差异有统计学意义(P＜0.01)；与模型组相比，阳性组、高/中剂量组T淋巴细胞增殖数量增多，差异有统计学意义(P＜0.01)，见表5。

表1 各试验组胸腺指数(±s)

表1 各试验组胸腺指数(±s)

组别 n 胸腺指数空白组 10 0.004 2±0.001 3模型组 10 0.002 5±0.000 4阳性药组 10 0.002 3±0.000 5低剂量组 10 0.002 1±0.000 4中剂量组 10 0.001 8±0.000 6高剂量组 10 0.002 9±0.000 8

表2 各试验组脾脏指数(±s)

表2 各试验组脾脏指数(±s)

组别 送检标本(n) OD空白组 4 0.003 0±0.000 3模型组 4 0.003 0±0.000 6阳性组 5 0.002 7±0.000 6低剂量组 5 0.002 3±0.000 4中剂量组 3 0.002 0±0.000 3高剂量组 6 0.002 7±0.000 5

NK 细胞、LAK 细胞活性测定结果，见表6。

巨噬细胞吞噬中性红能力：与空白组比较，模型组OD 值降低，差异有统计学意义(P＜0.01)；与模型组比较，阳性组OD 值增加，差异有统计学意义(P＜0.01)；与模型组比较，高、中剂量组OD 值增加，差异有统计学意义(P＜0.05)，见表7。

讨 论

机体处于免疫抑制状态时，机体的非特异性免疫功能下降，可表现为淋巴细胞增殖和分化能力下降。淋巴细胞分为许多功能特异的群体，比如T 淋巴细胞、B 淋巴细胞、NK 细胞等，本次实验即对这些细胞进行检测。其中检测T 淋巴细胞、B 淋巴细胞的增殖能力可以在一定程度上反映细胞免疫功能。不同于T 淋巴细胞和B 淋巴细胞，NK 细胞属于直接杀伤靶细胞效应的淋巴细胞。当机体的非特异性免疫功能下降时，也表现为NK 细胞活性降低。本实验采用MTT法检测NK 细胞和LAK 细胞的杀伤活性，作为判断机体免疫功能强弱的依据。在NK细胞活性测定中，与模型组相比，阳性组及益肾补气强身茶高、中、低剂量组的NK细胞活性有所升高。LAK细胞是体外诱导的非特异性杀伤细胞，许多研究表明，LAK 细胞的前体细胞就是NK 细胞。本研究中ConA 诱导的小鼠脾脏T 淋巴细胞增殖反应中，与模型组相比，阳性组及益肾补气强身茶高、中剂量组的脾脏细胞增多，结果显示补肾养身茶可以促进脾脏T 淋巴细胞的增殖，增强机体的非特异性免疫功能。与模型组相比，阳性组益肾补气强身茶高、中、低剂量组的LAK 细胞数值均有所升高，表明益肾补气强身茶对免疫抑制小鼠有一定增强免疫功能的作用。

表3 ACP活性测定(±s)

表3 ACP活性测定(±s)

注：与空白组比较，#P＜0.05；与模型组比较，⋆P＜0.05。

组别 样本数量(n) 活力(U/gprot)空白组 8 101 7.85±82.34模型组 11 898.66±94.51#阳性组 9 102 4.62±94.98⋆高剂量组 13 947.24±116.82中剂量组 6 104 4.03±163.25⋆低剂量组 9 894.39±144.49

表4 药物对肝组织中LDH活力的影响(±s)

表4 药物对肝组织中LDH活力的影响(±s)

注：与空白组比较，#P＜0.05；与模型组比较，⋆P＜0.05。

组别 样本数量(n) 活力(U/g prot)空白组 8 457 99.12±793 1.06模型组 7 310 77.26±896 6.49#阳性组 6 413 04.32±774 4.87⋆高剂量组 7 377 30.21±925 5.49中剂量组 6 408 39.31±111 83.70⋆低剂量组 6 383 30.89±910 9.67

表5 ConA、LPS诱导的小鼠脾脏细胞增殖的影响(±s)

表5 ConA、LPS诱导的小鼠脾脏细胞增殖的影响(±s)

注：与空白组比较，△△P＜0.05；与模型组比较，⋆P＜0.05，⋆⋆P＜0.01。

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表6 NK细胞、LAK细胞活性(%)

表7 对巨噬细胞吞噬功能的影响(±s)

表7 对巨噬细胞吞噬功能的影响(±s)

组别 n OD空白组 6 0.79±0.01模型组 6 0.72±0.02△△阳性组 6 0.77±0.01⋆⋆高剂量组 6 0.76±0.02⋆中剂量组 6 0.75±0.02⋆低剂量组 6 0.72±0.03

巨噬细胞是一种重要的免疫细胞，活化的巨噬细胞免疫能力更强，而巨噬细胞活化的一个重要标志是产生一氧化氮，实验分析了腹腔巨噬细胞的吞噬活性，在吞噬细胞吞噬能力测定中，与模型对照组相比，阳性组及高、中剂量组OD 值增加，间接说明了与模型组相比，这三个剂量组提高了免疫抑制小鼠巨噬细胞的吞噬能力。ACP 作为溶酶体酶，参与巨噬细胞吞噬外来病原体的过程，所以ACP 的活性高低在一定程度上反映了吞噬细胞的活化程度。本实验数据显示，益肾补气强身茶中剂量组能提高免疫抑制小鼠的ACP 活力。LDH 是糖降解的必须酶，而吞噬细胞的吞噬过程则需要糖降解提供的能量，所以LDH 的活性与巨噬细胞激活的程度相关，是巨噬细胞激活的标志之一。在本次实验中，LDH 活性测定结果显示，与模型组相比，阳性组、中剂量组LDH 活力升高。本研究证实，益肾补气强身茶各剂量组对免疫抑制大鼠表现出不同程度的增强免疫能力的作用，这为益肾补气强身茶的进一步应用提供了理论依据。