蒺藜配方颗粒HPLC指纹图谱研究

姚娜，黄燕明，陈桂生，李雪银，康志英

(1.广州市香雪制药股份有限公司，广东 广州 510663；2.宁夏隆德县六盘山中药资源开发有限公司，宁夏 固原 756300)

蒺藜配方颗粒是以蒺藜饮片为原料，经水提、浓缩、干燥、制粒和包装等工艺制备而成。原料蒺藜为蒺藜科植物蒺藜(TribulusterrestrisL.)的干燥成熟果实。秋季果实成熟时采割植株，晒干，打下果实，除去杂质。具有平肝解郁、活血祛风、明目止痒的功效。临床上用于头痛眩晕、胸胁胀痛、乳闭乳痈、目赤翳障和风疹瘙痒等[1-2]。蒺藜中的化学成分研究已有报道，主要含有皂苷类、黄酮类、生物碱、多糖类、甾醇类、氨基酸类、萜类、脂肪酸和无机盐等化合物[3-5]。研究表明，蒺藜具有抗衰老、降血糖、降血脂、性强壮及提高人体中性激素含量等作用，对肿瘤、高血压、细菌真菌感染和糖尿病等均有较好疗效[6-8]。

中药指纹图谱[9-13]具有全息性、客观性、准确性、整体性和模糊性的特征，能较好地表征中药化学物质组成的完成性及复杂性，能全面地反映中药中的化学成分信息，被广泛运用到中药和天然药物质量评价中,高效液相指纹图谱是应用最广的技术手段之一。目前国内尚无关于蒺藜配方颗粒指纹图谱研究的文献报道，国家亦未出台该中药配方颗粒国家标准。本实验采用HPLC-DAD法对蒺藜配方颗粒进行指纹图谱研究，结果该方法稳定、重复性好，可为蒺藜配方颗粒质量评价提供参考。

1 仪器与试药

十万分之一电子分析天平(MS205DU，瑞士Mettler toledo公司)；超纯水器(Simplicity，美国密理博Millipore公司)；数控超声波清洗器(KQ500DE，昆山市超声仪器有限公司)；Ultimate3000 DIONEX高效液相色谱仪；Agilent 1200高效液相色谱仪。

蒺藜对照药材(中国食品药品检定研究所，121296-701105，规格：3 g)；乙腈、冰醋酸(色谱级)；甲醇、正丁醇(分析纯)。

10批蒺藜配方颗粒均来自广州市香雪制药股份有限公司(批号依次为01～10，规格均为1.0 g/袋)；麦芽糊精(湖州展望药业有限公司)。

2 方法与结果

2.1 色谱条件与系统适用性试验

以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长为25 cm，内径为4.6 mm，粒径为5 μm)；以乙腈为流动相A，0.5%冰醋酸溶液为流动相B，按表1中的条件进行梯度洗脱；检测波长为320 nm；柱温30 ℃。结果见表1。

表1 梯度洗脱程序

2.2 参照物溶液的制备

取蒺藜对照药材3 g，精密称定，加水30 mL，回流提取1 h，过滤，滤液蒸干，残渣加甲醇使溶解，转移至5 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.3 供试品溶液的制备

取蒺藜配方颗粒约1 g，研细，精密称定，置锥形瓶中，加入1 g硅藻土，研磨混匀，精密加入水饱和正丁醇25 mL，超声处理30 min(功率300 W，频率40 kHz)，过滤，滤液蒸干，用甲醇溶解，转移至10 mL容量瓶中，用甲醇定容，滤过，即得。

2.4 测定法

分别精密吸取参照物溶液与供试品溶液各5 μL，注入液相色谱仪，测定，记录色谱图。

2.5 10批样品的检测结果

分别取10批蒺藜配方颗粒，按“2.3”项下方法制备10份供试品溶液，按“2.1”项下的色谱条件测定，得到10批蒺藜配方颗粒的色谱叠加图，采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》(2012.1版)对10批蒺藜配方颗粒指纹图谱进行计算，相似度达0.999以上。结果见图1～2和表2。

图1 10批蒺藜配方颗粒HPLC特征图谱叠加

2.6 指纹图谱中共有峰的确认

通过对10批蒺藜配方颗粒的HPLC指纹图进行分析，有10个色谱峰能稳定重现，故初步确立10个共有峰。经与蒺藜对照药材进行比对，2、3、4、5、6、9及10号共有峰的保留时间及紫外光谱与蒺藜对照药材均吻合。李瑞海[8]指出蒺藜的水溶性成分主要是黄酮、皂苷类，并对菝葜皂苷元进行了紫外光谱扫描，其图谱与上述共有峰的紫外光谱相似。故推测其为菝葜皂苷类成分，且其峰面积均大于总峰面积的3%，因此拟立2、3、4、5、6、9及10号共有峰为特征峰1～7号。

2.7 指纹图谱方法学考察

2.7.1 专属性试验

取蒺藜配方颗粒、麦芽糊精及蒺藜对照药材分别按“2.3”项下方法制备，按“2.1”项下的色谱条件测定，见图3，结果表明，7个共有色谱峰的鉴定均不受溶剂及辅料等因素干扰，具有良好的专属性。

图2 蒺藜配方颗粒HPLC指纹图谱共有模式

批号12345678910对照指纹图谱011.0001.0001.0001.0001.0001.0001.0000.9991.0001.0001.000021.0001.0001.0001.0001.0001.0001.0000.9991.0001.0001.000031.0001.0001.0001.0001.0001.0001.0000.9991.0001.0001.000041.0001.0001.0001.0001.0001.0001.0000.9991.0001.0001.000051.0001.0001.0001.0001.0001.0001.0001.0001.0001.0001.000061.0001.0001.0001.0001.0001.0001.0000.9991.0001.0001.000071.0001.0001.0001.0001.0001.0001.0000.9991.0001.0001.000080.9990.9990.9990.9991.0000.9990.9991.0001.0000.9990.999091.0001.0001.0001.0001.0001.0001.0001.0001.0001.0001.000101.0001.0001.0001.0001.0001.0001.0000.9991.0001.0001.000对照指纹图谱1.0001.0001.0001.0001.0001.0001.0000.9991.0001.0001.000

注：A:蒺藜对照药材;B:阴性对照;C:空白溶剂;D:蒺藜配方颗粒。图3 蒺藜配方颗粒HPLC指纹图谱专属性试验

2.7.2 精密度试验

取同一批蒺藜配方颗粒供试品溶液，按“2.1”项下的色谱条件于高效液相色谱仪上连续进样6次，记录色谱图，采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》(2012.1版)进行相似度评价，各图谱共有峰与对照指纹图相似度均达1.000，表明该仪器精密度良好。

2.7.3 重复性试验

取同一批蒺藜配方颗粒样品，平行6份，按“2.3”项下方法制备，按“2.1”项下的色谱条件分别进样，记录色谱图，各图谱特征峰的相似度为1.000，表明该方法重复性良好。

2.7.4 稳定性试验

取同一份蒺藜配方颗粒供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件，分别在0、2、4、6、8、12、24和48 h进样，记录色谱图，结果各图谱共有峰的相似度均为1.000，表明该供试品溶液在48 h内稳定性良好。

2.7.5 中间精密度试验

分别考察不同分析人员、不同日期和不同设备对精密度的影响，结果各图谱共有峰的相似度均达0.998以上，表明该方法中间精密度良好，随机变动因素不影响该方法精密度。

2.7.6 耐用性实验

取同一批蒺藜配方颗粒供试品，按“2.3”项下方法处理样品，分别使用Agilent Zorbax Eclipse Plus C18(3.0 mm×150 mm，3.5 μm)、Ultimate XB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)、Elite Hypersil ODS2(4.6 mm×250 mm，5 μm)三种型号的色谱柱，按“2.1”项下的色谱条件分别进样，记录色谱图，结果在不同色谱柱因素变动的条件下，各图谱共有峰的相似度均达0.994以上，表明该方法耐用性良好。

3 讨论

本实验对不同实验条件进行优化，考察了乙腈-0.5%磷酸溶液，乙腈-0.1%冰醋酸溶液，乙腈-0.5%冰醋酸溶液，乙腈-水等流动相体系；不同的柱温；全波长扫描考察了不同波长下供试品的指纹图谱。最终选取在柱温为30 ℃，检测波长为320 nm，以乙腈-0.5%冰醋酸溶液梯度洗脱，该条件下谱图色谱峰信息丰富，分离度好，稳定性好。

在色谱柱的选择中，根据蒺藜配方颗粒样品中的成分类别及理化性质，选用C18柱进行分离，分别考察了Ultimate XB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)、Elite Hypersil ODS2(4.6 mm×250 mm，5 μm)、Agilent Zorbax Eclipse Plus C18(4.6 mm×150 mm，3.5 μm)三种型号的色谱柱，各色谱峰均能达到基本分离，各型号色谱柱分离效果符合要求。

通过相似度计算软件得到10批蒺藜配方颗粒的对照图谱及各批样品与对照图谱之间的相似度，结果均大于0.99，表面各批次样品之间相关性较好，投料所用的蒺藜原药材质量较稳定，蒺藜配方颗粒工艺稳定。

综上所述，本实验中建立的采用HPLC检测蒺藜配方颗粒指纹图谱方法稳定性、重复性好，可为蒺藜配方颗粒质量控制和评价提供参考。