葱白提取物对动脉粥样硬化大鼠血管内膜脂质沉着及Bcl-2、PPARγ蛋白表达的影响

夏雯，雷杰，段刚峰，郑琼莉

(武汉市中西医结合医院，湖北 武汉 430022)

动脉粥样硬化(Atheroschlerosis,AS)是心、脑血管疾病的重要病因，以脂质沉积，内膜增厚及斑块形成为主要表现。而内皮细胞功能损伤是AS形成初期的重要环节。内皮细胞功能异常会引发血管损伤,引起AS的发生发展。B淋巴细胞瘤-2蛋白(Bcl-2)作为凋亡调控基因,对AS过程中的脂质氧化应激和炎症发生起到重要作用。而过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)作为转录调节因子，参与了脂质代谢、炎症及动脉粥样硬化的发生。《本草纲目》记载：葱白治疗“心急痛，牙关紧闭欲绝”，与现代医学冠心病症状相近。葱白提取物是从葱科植物细香葱(BulbusAlliiFistulosi)成熟茎下端葱白中提取的活性成分，前期实验发现,葱白提取物对急性心肌缺血大鼠心肌损伤具有保护作用[1-2]。本实验基于以上研究，拟建立动脉粥样硬化大鼠模型，观察葱白提取物对AS大鼠血管脂质沉着及Bcl-2、PPARγ蛋白表达的影响，为进一步阐明葱白提取物抗动脉粥样硬化机制提供实验支撑。

1 材料

1.1 动物

健康雄性SD大鼠，体质量(200±20)g，40只，由湖北省实验动物研究中心提供(动物合格证编号：No.42000600000069)。动物饲养于塑料笼内,每笼4只,自由饮用去离子水,室内温度为25℃,温度为60%,水及饲料均经过辐照消毒处理。

1.2 药品及试剂

葱白提取物(批号：20150326，武汉市中医西结合医院提供，经微波干燥和超临界萃取得到，干燥葱白超临界萃取的总得率在1.85%左右，主要含有含硫化合物、甾体、皂苷、不饱和脂肪酸等化合物，浓度为25%，配置成最终浓度为0.10 mg/mL的溶液)；辛伐他汀片(舒降之,批号：02001697，杭州默沙东制药有限公司，配置成最终浓度为10 mg/mL的溶液)；胆固醇、胆酸钠、丙基硫氧嘧啶和维生素D3粉剂(武汉宇阳锋锐生物科技有限公司)；其余试剂均为市售分析纯。

1.3 仪器

低温高速离心机(Sorvall Stratos，赛默飞，美国)；超低温冰箱(MDF-390AT， SANYO，日本)；组织包埋机(Leica公司，德国)；组织切片机(Leica公司，德国)；荧光显微镜(CX22，OLYMPUS公司，日本)；全自动生化分析仪(AU2700，贝克曼公司，美国)；垂直电泳仪(JY-SCZ，北京六一仪器厂)；凝胶图像分析仪(EBOX CX5，Viber Lourmat公司，法国)。

2 方法

2.1 动物分组及模型制备

大鼠适应性喂养1周后，随机分为假手术组、模型组、葱白提取物组和辛伐他汀组,每组10只。大鼠腹腔注射10%水合氯醛溶液(3 mL/kg)麻醉，仰位固定，备皮后酒精消毒,颈部正中切口，分离右侧颈总动脉，结扎其远心端，向心脏方向插入1.5 F球囊，进入4 cm后，向球囊内注水使球囊充盈后回拉约2～3 cm，反复3次，使内皮充分剥脱，完成后拔出球囊，结扎近心端血管，缝合切口。假手术组只进行手术操作，但不插入球囊损伤，其他操作同各实验组。术后腹腔注射青霉素3天预防感染。假手术组正常饮水，模型组及各治疗组给予高脂饲料(10%猪油、4%胆固醇、0.5%胆酸钠、0.2%丙基硫氧嘧啶加入85.3%的全价基础饲料)，并于手术后第3天于右下肢肌肉注射维生素D3针剂(3万U/kg)。

2.2 给药方法

造模后第1天起开始给药，假手术组和模型组灌胃等量蒸馏水(10 mL/kg)，中药组大鼠给予葱白提取物1 mg/kg灌胃，西药组给予辛伐他汀混悬液100 mg/kg灌胃，连续8周。

2.3 标本取材与制备

实验第12周，各组动物禁食过夜后麻醉动物，腹主动脉取血分离血清，保存在-80 ℃低温冰箱备用。打开胸腔，在主动脉弓起始段剪取1 cm主动脉标本，10%多聚甲醛溶液固定12 h。另取3 cm胸主动脉标本，去除脂肪组织，生理盐水冲洗后置于-80 ℃低温冰箱中冻存。

2.4 血脂水平检测

采用全自动生化分析仪，分析血清标本，检测血清总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL-C)和高密度脂蛋白(HDL-C)。

2.5 主动脉脂质沉积情况观察

将固定的胸主动脉标本用蒸馏水冲洗后，用油红O脂肪染色法，分析组织切片中的中性甘油三酯、脂质以及脂蛋白等脂质状况。

2.6 Bcl-2、PPARγ蛋白表达的检测

将冻存备用的标本取出提取组织总蛋白,并进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，将蛋白转移至PVDF膜上,用 5%脱脂牛奶室温封闭1.5 h, 分别加入对应一抗,4 ℃摇床孵育过夜, 次日弃去一抗, 洗涤后加入山羊兔二抗，室温孵育1 h, 洗涤后滴加HRP化学发光底物，孵育5 min,用计算机图形分析软件(Uvpgr32扫描，Gelw4d分析)自动分析图形的大小和灰度。

2.7 统计学处理

3 结果

3.1 各组大鼠血脂水平比较

结果如表1所示，与假手术组比较，模型组血清TC、TG、LDL-C的浓度明显升高，而HDL-C浓度则显著降低，两者比较差异具有统计学意义(P<0.05)；与模型组比较，葱白提取物组能够降低血清TC、TG、LDL-C浓度水平而升高血清中HDL-C的浓度，同时阳性对照组与葱白提取物组结果一致，也能显著改善血清血脂代谢水平，两组与模型组比较具有显著性差异(P<0.05)。葱白提取物组与辛代他汀组之间未见显著性差异(P>0.05)。

表1 葱白提取物对大鼠血脂水平的影响

注：与假手术组比较，*P<0.05；与模型组比较，△P<0.05。

3.2 病理组织学检测

如图1所示，与假手术组比较，模型大鼠胸主动脉血管壁有大量的脂质沉积，血管壁脂肪含量显著增加。和模型组比较，葱白提取物组和辛伐他汀组血管壁中脂质沉积显著减少，其中葱白提取物组减少更显著。

注:A.假手术组；B.模型组；C.辛伐他汀组；D.葱白提取物组。图1 各组大鼠血管壁检查(油红染色，×400)

3.3 葱白提取物对Bcl-2、PPARγ蛋白表达的影响

结果如表2、图2所示，模型组胸主动脉组织中Bcl-2、PPARγ蛋白表达水平均显著低于假手术组(P<0.05),而葱白提取物组和辛伐他汀组能够上调Bcl-2、PPARγ蛋白表达水平(P<0.05)，葱白提取物组和辛伐他汀组之间比较差异无统计学意义 (P>0.05)。

表2 葱白提取物对大鼠Bcl-2、PPARγ表达的比较

注：与假手术组比较，*P<0.05；与模型组比较，△P<0.05。

图2 各组大鼠主动脉Bcl-2、PPARγ蛋白表达水平

4 讨论

中医学中没有动脉粥样硬化(AS)的病名，根据其临床表现，可归属于“胸痹”的范畴。中医学认为,胸痹病因多样，病机复杂，汉代张仲景提出其病机为“阳微阴弦”,“阳微”即本质属阳气不足，血行不畅，“阴弦”即痰浊、瘀血等病理产物为患。AS过程中斑块形成多与脂质代谢异常相关，属于中医学“痰浊”范畴，而“辛温通阳”是治疗胸痹的根本方法，阳气一通，痰瘀得散，则心痛可除。葱白作为辛温通阳的代表中药，《本草纲目》言：“卒心急痛，牙关紧闭欲绝，以老葱白五茎去皮须，捣膏，以匙送入咽中，灌以麻油四两，但得下咽即苏。”指出单用葱白一味即可治疗胸痹，缓解心痛。《本草经集注》也记载：“葱白以升阳，云通者，一以温之而令阳气得入，一以发之而令阴气易散也。”

在AS形成的过程中，血脂水平异常对于AS发展以及心血管病发生有重要的预测意义。临床最常见的TC、TG、LDL-C和HDL-C血脂指标在AS斑块的形成及进展中较为关键。LDL-C水平可以加速AS的发展，LDL-C作为TC的主要载体，血清中升高的LDL-C经过氧化后形成氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)，会促进AS的发生[3-4]。而HDL-C可以影响胆固醇逆转运、改善内皮细胞功能、抗炎、抗血栓和促纤溶等多途径共同发挥抗AS的作用[5-6]。TC自身在血液循环中极易沉积在动脉壁上，并随着动脉壁细胞增生和纤维细胞堆积形成粥样硬化斑块[7]。从本实验结果可以发现，AS大鼠的血脂水平出现明显异常，表现为血清中TC、TG、LDL-C的浓度明显升高，而HDL-C浓度则显著降低，同时油红O染色发现AS大鼠胸主动脉血管壁有大量的脂质沉积，血管壁脂肪含量显著增加。而葱白提取物可以改善AS大鼠血脂水平，降低TC、TG、LDL-C的浓度而升高HDL-C浓度，同时减少血管壁脂质沉积，说明辛温通阳中药葱白可以调节脂质代谢，减少内膜脂质的形成, 起到抑制AS形成的作用。

Bcl-2作为一种细胞因子，主要参与细胞凋亡的线粒体途径，其表达增加可引起细胞增殖，表达下调则导致凋亡[8]。研究表明,在AS斑块中，Bcl-2参与血管平滑肌细胞、血管内皮细胞和巨噬细胞的凋亡过程，特别是对巨噬细胞的细胞凋亡发挥重要作用[9-10]。而过氧化物酶体增殖物激活受体 (PPARγ) 近年来也被发现与AS发生密切相关，主要表现在血管炎症反应和影响血管硬化的病理过程，主要通过调控脂肪细胞分化和脂质代谢, 调控糖稳态及胰岛素敏感性以及抗炎、抗增殖活性来发挥作用[11-12]。本研究发现，AS大鼠胸主动脉组织中Bcl-2、PPARγ蛋白表达水平是明显降低的，而通过葱白提取物干预后，AS大鼠Bcl-2、PPARγ蛋白表达水平明显升高，与阳性对照组辛伐他丁的作用结果一致，说明葱白提取物调节脂代谢，改善AS进展水平可能与调控Bcl-2、PPARγ蛋白表达水平有关。但葱白提取物发挥作用的具体机制仍未明确，这将是实验团队下一步的研究目标。