铁皮石斛粉对SD大鼠致畸作用研究

刘泳廷，高敏，刘佳，郑冲，刘玲，叶建方，苑洁

(贵州省疾病预防控制中心，贵州 贵阳 550004)

铁皮石斛(DendrobiumofficinaleKimura et Migo)为兰科石斛属多年生草本植物，别名黑节草、铁吊兰，是石斛属植物中药用价值最高的一种石斛。以新鲜或干燥的茎入药，作为滋阴清热、益胃生津润肺的传统中药，具有悠久的食用和使用方面的历史[1-3]。近年来，国内外学者对铁皮石斛的化学成分、药理活性和质量控制方法均开展了大量的研究。研究表明,铁皮石斛的成分主要为多糖和生物碱，含有少量的糖苷、菲类、联苄类和氨基酸等[4-5]，具有抗衰老、抗肿瘤、降低血糖、提高免疫功能等作用，对恶性肿瘤、胃肠道疾病、糖尿病、白内障、关节炎、血栓闭塞性脉管炎及慢性咽炎等有很好的疗效，治疗和保健意义非常重大[6-12]。但目前有关铁皮石斛及其同类产品毒理学安全性评价研究的资料少见报道，且未见生殖毒性及致畸作用的相关研究报道。贵州由于优越的地理位置及良好的生态环境,境内曾拥有丰富的野生铁皮石斛资源,是铁皮石斛的原产地之一[13-14]。本次研究拟对贵州产铁皮石斛粉致畸作用进行试验研究，旨在了解铁皮石斛粉对SD大鼠是否具有胚胎毒性和致畸毒性。

1 材料与方法

1.1 受试物

铁皮石斛粉为浅黄绿色粉末，由贵州某药业公司提供。人体口服推荐量为每日1.5 g。

1.2 对照药物

阿司匹林(规格：100 mg，批号：160528，上海蓝季科技发展有限公司)；阴性对照为蒸馏水。

1.3 实验动物及环境

SPF级健康成年SD大鼠，雌性120只(体质量230～260 g)，雄性60只(体质量300～330 g)，由贵州医科大学实验动物中心提供：SCXK(黔)2018-0001。动物质量合格证号：1202129。实验室屏障环境动物使用许可证：SYXK(黔)2014-001。温度：20℃～26℃,湿度：40%～70%。SPF级繁殖饲料由四川省医学科学院四川省人民医院实验动物研究所提供：SCXK(川)2015-01。

1.4 试验方法

1.4.1 分组与处理

实验共分5组，阴性对照组、阳性对照组及3个剂量组。按最大灌胃量法给予样品，剂量设计如下：铁皮石斛粉0.63 g/kgBW、1.25 g/kgBW和2.50 g/kgBW，相当于人体推荐摄入量的25倍、50倍和100倍，阴性对照组为蒸馏水，阳性对照组为阿司匹林(250 mg/kgBW)。低、中、高剂量组受试物配制为分别称取样品6.3 g、12.5 g、25.0 g加蒸馏水定容到150 mL；阳性对照组配制为称取阿司匹林2.5 g加蒸馏水定容到150 mL。每日即配即用，各组灌胃量均为15 mL/kgBW，每天1次。

1.4.2 方法

SD大鼠雌、雄按1:1合笼过夜后，每日早晨观察阴栓，查出阴栓认为该鼠已交配，当日作为“受孕”零天。确认的“孕鼠”随机分到各组，每组20只，并称重、编号，在受孕的第6～15天，各组每天经口给予受试物(灌胃体积15 mL/kgBW)。在0、6、9、12、15和20天分别称体质量一次，按体质量调整受试物灌胃量，并予记录，自由进食饲料。第20天颈椎脱臼处死母体，剖腹取出子宫，称子宫连胎重，记录黄体数、着床数、吸收胎、早死胎、晚死胎及活胎数，逐一记录胎鼠性别、体重、体长、胎盘重及外观有无畸形。每窝1/2活胎放入95%的乙醇中固定后放入10 g/L的氢氧化钾溶液内，透明后放入茜素红应用液中染色，在体视显微镜下检查有无骨骼畸形。另1/2活胎放入Bouins液固定2周后作内脏检查。

1.5 统计分析

应用SPSS18 FORWINDOWS统计处理，计量指标的组间差异采用方差分析，计数指标的组间差异采用卡方检验，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 对孕鼠一般状况及体质量的影响

在整个试验期间，各组孕鼠均未见异常症状和体征，也无死亡。阴性对照组孕鼠在整个妊娠期体质量增长正常。铁皮石斛粉低、中、高剂量组各时间点体质量增长正常，与阴性对照组比较无显著性差异(P>0.05)。阳性对照组孕鼠在妊娠第12天体质量增长减慢，显著低于阴性对照组(P<0.05)，见表1。

表1 铁皮石斛粉对孕鼠体质量的影响

注：与阴性对照组比较，*P<0.05。

2.2 对孕鼠胚胎发育的影响

阴性对照组子宫连胎重、黄体数、着床数、活胎数和胎鼠体质量、身长、胎盘重等均正常。铁皮石斛粉低、中、高剂量组平均活胎体质量、平均活胎体长、平均胎盘重与阴性对照组比较有统计学差异(P<0.05)，但无明显的剂量-反应关系，且均在本实验室基础数据正常范围内，其余指标与阴性对照组比较均无显著性差异(P>0.05)。阳性对照组吸收胎率显著高于阴性对照组(P<0.01)；子宫连胎重、平均活胎体重、平均活胎体长均显著低于阴性对照组(P<0.01)，说明阿司匹林有明显的胚胎毒性。各剂量组均未出现死胎，外观检查仅阳性对照组有3只胎鼠脑膨出合并脊柱裂，外观畸形率1.50%，见表2和表3。

注：与阴性对照组比较，**P<0.01。

表3 铁皮石斛粉对活胎鼠生长发育的影响

注：与阴性对照组比较，*P<0.05，**P<0.01。

2.3 对胎鼠骨骼的影响

铁皮石斛粉各剂量组胎鼠骨骼改变主要为胸骨缺失、胸骨骨化不全、14对肋和短肋，与阴性对照组比较无显著性差异(P>0.05)，表明铁皮石斛粉对胎鼠骨骼分化无不良影响。阳性对照组胎鼠骨骼畸形主要为头骨骨化异常、脊椎椎体分岔、椎体单侧骨化、颈椎间隙增宽、15对肋、胸骨缺失，畸形率高达98.95%，显著高于阴性对照组(P<0.01)，见表4、图1。

表4 铁皮石斛粉对胎鼠骨骼发育的影响

注：与阴性对照组比较，**P<0.01。

2.4 对胎鼠内脏的影响

铁皮石斛粉低、中、高剂量组和阴性对照组未发现有内脏畸形；阳性对照组见内脏异常胎鼠数13只，主要为脏器淤血，并见侧脑室扩张2只、肾盂扩张2只、肾偏小1只，内脏畸形率12.38%，显著高于阴性对照组(P<0.01)，见表5。

3 讨论

致畸作用是发育毒性中最主要的一种表现，通过检测妊娠动物接触受试物后引起的致畸可能性，可预测其对人体可能的致畸性，是衡量外来化合物发育毒性的重要指标。母体在孕期受到可通过胎盘屏障的有害物质的作用，会影响胚胎的器官分化与发育，导致结构异常，出现胎鼠畸形。因此，在受孕动物的胚胎着床后，器官形成期给予受试物，可检出该物质对胎鼠的致畸作用。本次研究用铁皮石斛粉在孕鼠的致畸敏感期进行染毒，不但能检测铁皮石斛粉的致畸性，还可以观察其致胚胎、胎鼠死亡和生长迟缓等资料。

注：①⑤阴性对照组；②③④⑦⑧阳性对照组(箭头所示分别为②囟门偏大，③枕骨Ⅰ级，④囟门偏大、枕骨骨化不全,⑦双侧波形肋，⑧第14胸椎椎体单侧骨化，第11、12胸椎椎体分岔)；⑥铁皮石斛高剂量组：双侧短肋。图1 体视显微镜下观察阿司匹林和铁皮石斛粉对胎鼠骨骼发育的影响

组别受检胎鼠数头部胸部腹部内脏畸胎数内脏畸形率(%)脑/脑室出血围脑膜下出血侧脑室扩张小眼/无眼胸腔淤血肺偏小腹腔淤血肝淤血肾脏偏小肾盂扩张阴性对照组124000000000000.00低剂量组116000000000000.00中剂量组113000000000000.00高剂量组118000000000000.00阳性对照组10521203021121312.38**

注：与阴性对照组比较，**P<0.01。

本次研究中，设定的阳性对照物为阿司匹林，剂量250 mg/kgBW，实验孕鼠呈现明显的胚胎毒性和致畸胎作用，其中子宫连胎重、平均活胎体质量、平均活胎体长均显著低于阴性对照组，外观检查有3只胎鼠见脑膨出合并脊柱裂，吸收胎率9.91%，骨骼畸形率98.95%，内脏畸形率12.38%，均显著高于阴性对照组，这与本实验室以往设立的阳性对照模型结果相吻合，提示本次研究所选SD大鼠种属对致畸物反应敏感。

本次研究采用最大灌胃量法设计给予受试物，因铁皮石斛粉为一种易吸水、黏稠度高的物质，故设计的最高剂量为2.5 g/kgBW，达到每日人体推荐剂量的100倍。实验期间未见孕鼠进食量减少及其他母体中毒症状，铁皮石斛粉各剂量组孕鼠增重、黄体数、着床数、活胎数、吸收胎数和死胎数未见异常，对胎鼠体质量、胎盘重、身长、骨骼和内脏也未见明显影响。铁皮石斛粉在达到人体推荐量100倍的剂量对大鼠未显示明显的母体毒性、胚胎毒性和致畸性，致畸毒性的无明显有害作用水平为2.5 g/kgBW，提示铁皮石斛粉对人体可能无明显的致畸作用。本次研究为铁皮石斛作为药物、保健食品、新食品资源的开发利用提供了生殖毒理学参考依据。