黄芪多糖对骨骼肌成肌细胞增殖作用的研究

邓聪 ，杨志敏，徐福平 ，孙玉姣，陈玉状，赖艳娴，岑美婷

(1.广州市第一人民医院南沙医院，广东 广州 511457；2.广州中医药大学第二临床医学院，广东 广州 510120)

衰老对所有生物而言都是不可避免的，社会人口老龄化已是各国面临的严峻问题。据2011～2015年统计，我国≥60岁老年人口比重由13.3%增加到16%，并以每年3%的速度增长，是同期其他人口增长速度的5倍[1]。随着年龄的增长，机体的骨骼肌质量也随之减少，主要表现为肌肉体积、横断面积以及肌纤维数量的变少，出现老年性骨骼肌减少症，又称肌肉减少症(Sarcopenia)。肌肉减少症是衰老过程中发生的主要变化[2]，因此，从骨骼肌萎缩角度研究人体衰老的防治具有重要意义[3]。黄芪具有益气生肌的作用，广泛用于各补益类方剂中，黄芪多糖(Astragalus polysaccharides，APS)是其主要生物活性成分之一。现代药理研究发现，黄芪有良好的抗氧化、增强免疫、抗衰老等作用[4]。本实验通过研究APS对骨骼肌成肌细胞的增殖作用，为课题组的进一步研究提供实验依据。

1 材料和方法

1.1 实验材料

小鼠C2C12骨骼肌细胞(中科院细胞库)；APS(美国泛华生物公司)；新生胎牛血清(四季青生物工程研究所)；DMEM高糖培养基(Hyclone公司)；地塞米松、MTT(Sigma公司)。

1.2 细胞制备

C2C12骨骼肌细胞用含10%新生胎牛血清的DMEM高糖培养基培养(37℃，5% CO2，95%湿度)，观察细胞肌管分化情况，以两核以上呈串珠样的肌管达80%以上为肌管分化成功。

1.3 实验分组

将分化成功的C2C12骨骼肌成肌细胞(以下称成肌细胞)以5×104个/mL密度接种于96孔培养板，每实验组6个复孔，待细胞贴壁后，按APS不同浓度分为0.1、0.2、0.4、0.8和1 mg/mL 5组；按DEX不同浓度分为1、10、100和1 000 μM 4组，并设正常对照组。培养12 h、24 h。根据上述实验结果选取有统计学意义的APS、DEX浓度，再分为3组进行干预实验(DEX组、DEX+APS组、正常对照组)培养24 h。

1.4 成肌细胞增殖率和抑制率

用MTT法检测，将每孔的上清吸弃，分别加入50 μL MTT，放置于37 ℃温育4 h，然后吸弃上清，每孔加入200 μL DMSO，振荡10 min，在酶标仪上用570 nm波长测各孔OD值。并设调零孔。

细胞增殖率(%)=(实验组OD值-调零组OD值)/(对照组OD值-调零组OD值)×100%

细胞抑制率(%)=(1-细胞增殖率)×100%

1.5 成肌细胞肌管横径

成肌细胞用玻片培养，甲醛固定，HE染色，用200倍光镜随机依次选取左上、右上、左下、右下和中间5个视野进行观察，结果用Image Pro-Plus 6.0软件分析。横径为细胞核到肌管边缘的最短距离。

1.6 成肌细胞凋亡率

用AnnexinV-FITC凋亡试剂盒检测。胰酶消化细胞后，PBS洗涤2次，计数取1×106个/mL细胞，加入5 μL Annexin V-FITC、5 μL碘化丙啶，避光孵育10 min，流式细胞仪检测。

1.7 统计学处理

2 结果

2.1 APS对成肌细胞增殖的影响

两时间段OD值，除0.8 mg/mL APS组外，其余APS浓度组与对照组比较均有统计学差异(P<0.05)。两时间段增殖率，与对照组比较，APS分别为0.1、0.2、0.4、0.6 mg/mL时增殖率均升高(P<0.05)；APS为0.8 mg/mL时无统计学差异(P>0.05)；APS为1 mg/mL时增殖率下降(P<0.05)。结果见图1和图2。

注：与对照组比较，*P<0.05。图1 不同浓度APS对成肌细胞OD值的影响

注：与对照组比较，*P<0.05。图2 不同浓度APS对成肌细胞增殖率的影响

2.2 DEX对成肌细胞抑制的影响

与两个时间段对照组比较，DEX为100、1 000 μM时OD值均降低而抑制率均升高(P<0.05)；DEX为10 μM时OD值及抑制率，24 h时有统计学差异(P<0.05)，12 h时无统计学差异(P>0.05)；DEX为1μM时无统计学差异(P>0.05)。结果见图3和图4。

注：与对照组比较，*P<0.05。图3 不同浓度DEX对成肌细胞OD值的影响

注：与对照组比较，*P<0.05。图4 不同浓度DEX对成肌细胞抑制率的影响

2.3 各组成肌细胞OD值和成肌细胞肌管横径的比较

根据上述实验统计结果，选取APS 0.2 mg/mL，DEX 100 μM为干预浓度。与对照组OD值比较，12 h内DEX组、APS+DEX组及24 h内DEX组均有统计学差异(P<0.05)，24h内APS+DEX组无统计学差异(P>0.05)。

与对照组比较，DEX组肌管横径下降(P<0.05)，APS+DEX组无差异(P>0.05)。APS+DEX组与DEX组肌管横径比较有统计学差异(P<0.05)。结果见表1。

2.4 各组对成肌细胞凋亡率的比较

与对照组比较，DEX组和APS+DEX组细胞凋亡率均上升(P<0.05)。APS+DEX组和DEX组比较有统计学差异(P<0.05)。结果见表1和图5。

3 讨论

衰老是一个综合表现，包括身体、认知及精神等方面。人体的肌肉骨骼系统，如肌肉、骨头和关节等均受到衰老的影响，萎缩的骨骼肌会影响身体机能[5]。肌肉减少症是一种以老年人骨骼肌质量、肌量、功能下降为主要表现的病症。随着机体年龄增长，骨骼肌的结构和功能也发生退变，从而加速了神经系统、心血管系统以及其他组织器官的衰老[6]。研究已证实肌肉减少症与不良结局相关，如跌倒、残疾、住院、长期护理、生活质量变差和死亡率等，这些都表明防治肌肉减少症对老年人保健的重要性[2]。

表1 各组成肌细胞OD值、凋亡率、肌管横径的比较

注：与对照组比较，*P<0.05；与DEX组比较，#P<0.05。

图5 各组凋亡图

目前体育锻炼和营养支持被认为是预防和治疗与年龄相关的肌肉异常的基础[7],但缺乏有效的治疗方法[8]。肌肉减少症可归属于中医学“虚弱”“痿证”等范畴，以年老体弱，脾肾气虚为主要病机，而益气健脾、补养后天是关键。补气药黄芪见于各经典补益方中，具有补气生肌、固表、托毒排脓等功效。APS是黄芪的主要活性成分，含量高达50%以上。本实验发现，APS对正常成肌细胞有良好的增殖作用。在0.6 mg/mL浓度以下增殖率显著提高，并在0.2 mg/mL达到峰值，提示0.2 mg/mL是APS的最佳实验浓度，而在0.8 mg/mL之后则出现抑制，这可能与浓度过高产生细胞毒性有关。

成肌细胞萎缩模型的建立，动物模型主要通过去神经或代谢营养等因素实现，细胞模型则主要通过化学或生物制剂干预，如TNF-α、DEX和睾丸酮等。研究表明,在诱导C2C12肌管萎缩时，DEX的效果可能更优[9]。本实验结果显示，100 μM以上浓度的DEX对成肌细胞有显著的抑制作用，24 h抑制率分别为100 μM 38%、1 000 μM 54%，本实验选取100 μM浓度进行成肌细胞萎缩模型造模。在给予0.2 mg/mL APS干预24 h后，细胞OD值和肌管横径均升高(P<0.05)，凋亡率下降(P<0.05)，提示APS对防治肌肉减少症有一定的作用，但具体的机制有待下一步的研究。