东北山葡萄酿酒酵母的分离与鉴定

李海涛，刘艳环，苗利光※，张雪梅

（1.中国农业科学院特产研究所，长春 130112；2.延边大学农学院动物医学系，吉林 延吉 133000）

酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）又称面包酵母、出芽酵母，是与人类关系最广泛的一种酵母，也是发酵中最常用的生物种类。酿酒酵母在麦芽汁琼脂培养基上菌落为乳白色、有光泽、平坦、边缘整齐，无性繁殖以芽殖为主。在生理特性方面，能发酵葡萄糖、麦芽糖、半乳糖和蔗糖，不能发酵蜜二糖[1]。近些年来，应用于酵母菌分类的鉴定系统包括 Biolog、API20C、ATB32C、Vitek YBC 和 API Candida 系统。传统的鉴定方法在鉴定过程中，由于生理生化特性可能会被某些因素改变，造成鉴定结果存在偏差[2]。随着DNA 技术的发展，在酵母菌鉴定中的应用越来越成熟。酵母基因大亚基26S rRNA 的D1/D2 可变区序列高度保守性[3-7]，可以应用于酵母种的鉴定。

本研究采集吉林地区山葡萄产区的山葡萄和葡萄园土壤样本18 份，经实验室分离、纯化、微生物生理生化鉴定和分子生物学鉴定，成功分离出18 株酵母菌，其中有酿酒酵母12 株、发酵毕赤酵母3 株、乳酸克鲁维酵母3 株，为后续酿酒酵母的深入研究奠定了基础。

1 材料、仪器与试剂

1.1 材料

从吉林市昌邑区左家镇中国农业科学院特产研究所野生山葡萄园（ZJ）、吉林市昌邑区左家镇农大红山葡萄园（NDH）、通化市柳河县青木原山葡萄基地（LH），分别采集成熟的山葡萄样本和山葡萄园土壤样本各3 份，样本总计18 份，装入无菌袋中常温保存，立即进行实验室菌种分离鉴定。

1.2 仪器与试剂

恒温培养震荡器（ZDP-250，上海精宏实验设备有限公司）；微生物培养箱（DHP，上海一恒科学仪器有限公司）；生物安全柜（Thermo 1300 Series A2）、PCR 仪（Veriti）〔赛默飞世尔科技（中国）有限公司〕；台式冷冻离心机（5415R，德国艾本德股份公司）；凝胶电泳仪（Bio-Rad PowerPac HC）、紫外凝胶成像仪（Bio-Rad Gel DocTMXR+）（美国伯乐生命医学产品有限公司）。

麦芽汁培养基（青岛海博生物技术有限公司）；酵母粉、蛋白胨（英国Oxoid 公司）；酵母基因组DNA 提取试剂盒、LA-Taq DNA 聚合酶、DNA Maker〔宝生物工程（大连）有限公司〕；其他试剂均为国产分析纯。

2 方法

2.1 菌种的筛选

麦芽汁固体培养基：麦芽汁培养基131 g、琼脂粉20 g，加蒸馏水至 1 L，121 ℃灭菌 30 min，然后倒入平板，冷却后4℃保存备用。YPD 液体培养基：2%葡萄糖、2%蛋白胨、1%酵母粉，121℃灭菌30 min，冷却后4 ℃保存备用。

称取每份山葡萄样本10 g，置于无菌研钵中研磨，将山葡萄汁转入100 mL 灭菌蒸馏水的三角烧瓶中充分振荡15 min；称取采集的土壤样本每份1 g，加入至9 mL 的灭菌蒸馏水中，充分振荡10 min，静置5 min。分别10 倍梯度稀释山葡萄汁水溶液和土壤水溶液至104、105，取稀释液 100uL 涂布麦芽汁固体培养基平板，28 ℃倒置培养3 d，观察菌落生长情况。

2.2 菌株的分离优化

挑取麦芽汁琼脂培养基中生长情况良好的单菌落，转移至含有50 mL YPD 培养基的三角烧瓶中，12层纱布封口，30 ℃、180 r/min振荡培养36 h，测定细菌生长浓度OD600值。

2.3 菌株理化性质鉴定

糖发酵实验对分离的菌株进行理化性质鉴定[8-10]。

2.4 酵母基因组的提取

取 1～2×108酵母菌的过夜培养液至 1.5mL 的Microtube 中，12 000 r/min 离心 1 min。弃去上清，加入500uL 的GenTLE Yeast Solution A，轻微振荡重悬沉淀，37℃温浴1 h，期间轻轻振荡离心管数次。加入100uLGenTLE Yeast Solution B，轻微振荡混匀，70 ℃温浴10 min。加入200uLGenTLE Yeast Solution C，轻微振荡混匀，冰浴5 min，12 000 r/min 4 ℃离心5 min。取上清于新的离心管中，加入1/2 体积的异丙醇，上下颠倒离心管充分混匀，12 000 r/min 4℃离心5min，弃上清。加入500uL 预冷的70%乙醇，轻轻颠倒洗涤沉淀，12 000 r/min 4 ℃离心5 min，弃上清。室温下干燥，加入适量的TE Buffer 溶解，20℃保存备用。

2.5 特异性引物

上游引物：5'-GCTTAGTACGGCGAGTGAAG-3'

下游引物：5'-TGCTGGCCCAGTGAAATGC-3'

2.6 26SrRNA基因的扩增和测序

以提取的酿酒酵母基因组DNA为模板，采用26S rRNA D1/D2 区具有特异性的引物，进行26S rRNA的PCR 扩增。扩增反应体系（50uL）：50 ng 酵母基因组DNA 模板、2uL dNTP mixture、上下游引物（终浓度0.25 mol/L）、0.5uL DNA Taq 聚合酶、5uL10×PCR Buffer。反应参数：95 ℃预变性 5 min，30 个循环包括95 ℃变性 1 min，49 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 1 min，72 ℃延伸30 min。PCR 反应产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测。对获得的酵母菌菌株26S rRNA D1/D2 基因进行测序，测序结果在NCBI 核酸序列数据库中进行同源性比对。

3 结果

3.1 菌株筛选

在采集的各土壤和山葡萄样本中均有圆润、白色、整齐、形态较好的单菌落生长。

3.2 菌株的分离优化

挑取其中生长良好的单菌落共计27 个菌落，转入YPD 液体培养基中进行菌株分离优化，测定24 h 和36 h 的生长速度，以OD600计算，结果见表1。其中，编号为ZJ-02、ZJ-06、NDH-01、NDH-05、NDH-09、LH-03、LH-05、LH-06 和 LH-08 共 9 株菌生长情况较差，后续研究将这9 株菌舍弃。

表1 酵母菌株的生长速度结果Table 1 Physiological and biochemical properties of yeasts

3.3 菌株理化性质鉴定

分离的18 株酵母菌都能对葡萄糖发酵，个别菌株对乳糖、半乳糖、蔗糖和麦芽糖有发酵，与分离优化试验中在YPD 培养基中利用葡萄糖作为碳源的生长状况相一致。见表2。

表2 酵母菌株的理化性质鉴定结果Table 2 Physiological and biochemical properties of yeasts

3.4 基于26SrRNA D1/D2区的分子生物学鉴定

分离的18 株酵母菌26S rRNA D1/D2 区基因序列经过PCR 克隆和测序后，在NCBI GeneBank 数据库中进行序列比对，依据分离株与标准株亲缘关系，构建系统发育树（图1），并对分离株进行分类（表3）。

图1 系统发育树Fig 1 Phylogenetic tree

表3 酵母菌的26S rRNA D1/D2 区序列鉴定结果Table3 The result of 26S rRNA D1/D2 sequence of yeast identification

4 结论

山葡萄作为酿酒原料已经有70 多年的历史[11-12]，酵母是酿酒工艺中最关键的因素之一[13-16]。本研究选择的样本采集地点位于吉林省内山葡萄优质产区和种植资源基地，种质优良、资源丰富。从采集的土壤和山葡萄样本中经过菌株的分离优化、生理生化试验和分子生物学鉴定，成功分离出18 株酵母菌，其中有酿酒酵母12 株、发酵毕赤酵母3 株、乳酸克鲁维酵母3株；从样本分布区域来看，分离出的酿酒酵母大多数为自然生长酵母菌，占本次分离结果的66.7%。为酿酒酵母菌株选育、饲料酿酒酵母产品、有机矿物元素酵母铁酵母铜饲料添加剂产品的研究提供了充足的菌种资源。