非小细胞肺癌患者EGFR基因突变

袁世洋 贺荣芝 谢军平 刘川 盛天乐 蔡婧 李里香 邹叶青

(南昌大学第二附属医院 1江西省分子医学重点实验室，南昌 330006；2呼吸与危重症医学科；3病理科；4肿瘤科)

约80%以上肺癌是非小细胞肺癌(NSCLC)，在全世界范围内，肺癌已成为癌症致死的主要原因之一〔1〕。中国晚期原发性肺癌诊治专家共识(2016年版)〔2〕指出：“推荐所有病理诊断为肺腺癌、含有腺癌成分和具有腺癌分化的NSCLC患者进行表皮生长因子受体(EGFR)基因突变检测，建议对小活检标本诊断的或不吸烟的鳞癌患者也进行检测，如果肿瘤标本不可评估，可从血液(血浆)标本中获得循环肿瘤(ct)DNA进行评估”。目前，EGFR-酪氨酸激酶抑制剂(TKI)的分子靶向治疗已成为具有EGFR敏感突变的NSCLC患者的一线治疗方案。据报道，不同EGFR基因突变类型对EGFR-TKI的临床疗效不同〔3～6〕。因此，对于NSCLC患者，临床医生不仅需要了解该患者是否具有EGFR基因突变，还需要了解具体突变类型。由于基因突变检测费用相对较高且需要肺穿刺取材，目前也有相当一部分患者在未经EGFR基因检测前尝试EGFR-TKI的治疗。本研究拟探讨NSCLC患者EGFR基因突变情况。

1 资料和方法

1.1一般资料 收集2013年12月至2018年3月南昌大学第二附属医院检测EGFR基因突变且未经EGFR-TKI治疗的NSCLC组织标本及对应的临床资料〔包括年龄、性别、癌胚抗原(CEA)、肺癌病理类型、临床TNM分期、合并的基础疾病等〕。共收集并匹配到相应临床资料病例673例，男400例，女273例，平均年龄(61.2±10.7)岁。经手术获取的组织石蜡包埋样本94例，经皮肺穿刺获取的组织石蜡包埋样本479例，纤维支气管镜获取的组织石蜡包埋样本90例，经淋巴结穿刺及胸膜活检获取的组织石蜡包埋样本10例。腺癌616例，鳞状细胞癌39例，肺腺鳞癌7例，大细胞肺癌、未定型的NSCLC及含腺成分的混合型肺癌11例。

1.2仪器与试剂 ABI7500实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)仪(美国life公司)，样本的DNA抽提试剂盒及EGFR基因突变检测试剂盒均购自厦门艾德生物医药有限公司。

1.3石蜡样本的脱蜡及DNA抽提 每例石蜡包埋样本选取5～10片，置于1.5 ml离心管中，使用二甲苯、无水乙醇进行常规脱蜡处理后沉淀、烘干；采用AmoyDx®甲醛溶液固定和石蜡包埋样本DNA分离试剂盒(离心柱型)，严格按照产品说明书提取DNA。

1.4突变扩增阻滞系统(ARMS)-PCR法检测EGFR基因突变 试剂盒采用PCR管设计，双探针，ABI7500仪器检测，检测位点为包含19-Del、L858R、T790M、20-Ins、G719X、S768I、L861Q。每个PCR反应管内均含有5～10 pmol/L特异性引物、20 pmol/L双环探针、12.5 μmol/L三磷酸碱基脱氧核苷酸、175 μmol/L氯化镁、1 mmol/L硫酸铵、2.5 mmol/L氯化钾和纯化水等。42℃ 5 min，94℃ 3 min，94℃ 15 s，60℃ 60 s，共40个循环。

1.5统计学方法 采用SPSS23.0软件进行χ2检验、多因素Logistic回归分析。

2 结 果

2.1NSCLC患者EGFR基因突变情况 共检出330例EGFR基因阳性突变，总体突变率为49.0%。19-Del 168例(50.9%)，L858R 122例(37.0%)，S768I 2例(0.6%)，G719X 3例(0.9%)，L861Q无检出，T790M 2例(0.6%)，20ins 5例(1.5%)，19-Del+L858R 8例(2.4%)，19-Del+T790M 5例(1.5%)，G719X+L861Q 2例(0.6%)，G719X+S768I 2例(0.6%)，L858R+T790M 10例(3.0%)，T790M+20ins 1例(0.3%)。在所有突变类型中，以敏感性突变19-Del、L858R为主，占总体突变的87.9%(290/330)，明显高于其他突变类型。19-Del突变率显著高于L858R(P<0.001)。

2.2NSCLC患者EGFR基因突变与临床特点 EGFR基因突变与患者性别、年龄、吸烟史、病理类型及CEA水平相关(P<0.01、P<0.001)，与临床分期无关(P>0.05)，见表1。不吸烟的女性患者EGFR基因突变率高达69.3%(185/267)。CEA阳性不吸烟女性肺腺癌患者EGFR基因突变率高达78.3%(130/166)。而大细胞肺癌患者中未发现EGFR基因突变。

表1 EGFR基因突变患者临床特点〔n(%)〕

2.3NSCLC患者EGFR基因突变的多因素Logistic回归分析 病理类型、CEA水平、年龄、性别是EGFR基因突变的预测因素，而吸烟史和临床分期和EGFR突变不存在明显相关性。见表2。

2.4NSCLC患者EGFR基因突变与合并基础疾病的关系 共175例合并基础疾病，冠心病4例，支气管扩张3例，哮喘1例，高血压、慢性支气管炎混合10例，高血压、肺结核混合6例，高血压、冠心病混合1例。与未合并基础疾病的患者相比，合并单一糖尿病的患者EGFR L858R突变率显著升高(P=0.001)。而合并单一糖尿病的患者19-Del突变率未见明显差异(P>0.05)。见表3。

表2 多因素Logistic回归分析NSCLC患者EGFR基因突变的预测因素(n=673)

表3 NSCLC患者EGFR基因突变与合并基础疾病的相关性〔n(%)〕

与无基础疾病比较：1)P<0.01；2)未纳入合并基础疾病≤10例患者

3 讨 论

EGFR基因是NSCLC极为重要的驱动基因之一，常见突变19-Del、L858R和罕见突变S768I，G719S、L861Q为EGFR-TKI的敏感型突变，T790M和20ins为耐药型突变〔7〕。多项临床研究结果显示，和标准一线化疗方案相比，对有EGFR基因敏感突变的NSCLC患者接受EGFR-TKI(吉非替尼、厄洛替尼、阿法替尼)靶向治疗可获得显著提高治疗效果及无进展生存期及良好的耐受性〔8～10〕。既往DNA直接测序作为EGFR基因检测的金标准，但该方法对检测样本要求高(突变细胞占总标本的20%以上)，且灵敏度低，容易漏检部分突变标本。而ARMS法可检测出含1%突变细胞的标本，其敏感度高〔11〕。本研究结果和既往报道亚裔和中国人群EGFR基因突变率基本相似〔12，13〕。地区不同，EGFR总体突变率及主要突变类型存在差异，如宣威、福州地区以21号外显子L858R突变为主，而广西地区以19-Del突变为主〔14～16〕。本研究19-Del突变率高于L858R。

在本研究中，女性、肺腺癌患者的EGFR基因突变明显高于男性、非腺癌患者，和既往的相关报道结果一致〔17，18〕。年龄是否和NSCLC患者EGFR基因突变具有相关性，目前尚无定论。Sacher等〔19〕纳入2 237例NSCLC患者，分析年龄与EGFR、间变性淋巴瘤激酶(ALK)、原癌基因1酪氨酸激酶(ROS1)、V-raf鼠肉瘤素原癌基因同源基因B(BRAF)-V600E及K鼠肉瘤病毒基因(KRAS)等基因突变状态的相关性，多因素Lgoistic回归分析结果显示，EGFR和ALK基因突变和更小的年龄相关。Tjulandin等〔20〕的研究共纳入838例NSCLC患者，EGFR基因突变率为10.1%，多因素Logistic分析模型结果同样显示了年龄是EGFR基因突变的独立预测因子，低于60岁的NSCLC患者EGFR基因突变率更高。而国内有多项研究结果显示EGFR基因突变状态和年龄不存在相关性〔16，21，22〕。本研究多因素Logistic分析模型结果显示，EGFR基因突变和年龄相关，年龄低于60岁是EGFR基因突变的预测因子。

目前认为，吸烟是EGFR基因突变与否的预测因子之一〔23〕。在本研究中，单因素分析结果显示吸烟状态是EGFR基因突变的预测因素，但并未进入多因素回归模型。其原因可能是吸烟和其他因素产生交互效应。此外，这也是回顾性分析的不足之处，仅根据病例资料，无法准确得到每一例患者的吸烟状态。而且，女性存在油烟、二手烟等吸入情况，大部分病例资料也未能提及。

血清或胸水CEA水平和EGFR基因突变状态密切相关，目前这一观点已被国内外学者认可〔24～27〕。CEA水平能预测EGFR基因突变与否的原因可能在于EGFR基因突变时激活下游转导途径，破坏细胞凋亡机制的同时引起CEA蛋白表达增加〔28〕。EGFR基因突变可能和基础疾病存在相关性，如高血压、糖尿病等基础疾病引起肿瘤微环境的变化导致EGFR基因突变差异目前尚未能知，值得进一步探讨。Hakonen等〔29〕研究结果说明了EGFR L858R突变与糖尿病的潜在联系，其通过在胰岛素启动子下建立EGFR L858R表达的转基因小鼠模型，探讨在转基因小鼠模型中，EGFR激活是否触发对糖尿病Beta细胞凋亡的保护作用。结果显示EGFR L858R可能通过抑制促凋亡蛋白BCL2-Like 11(BIM)表达保护胰岛细胞因子介导的Beta细胞凋亡。但目前尚未发现有关2型糖尿病与NSCLC患者EGFR突变存在直接相关性的研究。而本研究收集到合并单一糖尿病的NSCLC患者数较少，需大样本的前瞻性研究进行验证。