猪源枯草芽孢杆菌的分离鉴定及其生物特性研究

袁 林,涂熠坤,2,曾 静,郭建军

(1.江西省科学院微生物研究所,江西 南昌330096;2.南京工业大学化学与分子工程学院,江苏 南京210000)

含有益生菌的微生态制剂能够改善因长期使用抗生素药物所带来的副作用,微生态制剂由于具有无药物残留、无毒副作用、细菌不产生耐药性等特点[1],且可以调节肠道微生态环境,防治动物肠道疾病,提高动物的抗病能力和生产性能[2],因此,在养殖行业具有广阔的应用前景。枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis,B.subtilis)是我国农业部允许作为饲料添加剂的两种芽孢杆菌之一,因具有改善消化道内环境、促进动物生长、提高动物机体免疫力及产生多种酶类、提高消化酶活性等功能[3],故具有广阔的发展前景,并在饲料添加剂、生物农药、污水处理、疫苗载体等[4]各方面已经得到了广泛的应用。

枯草芽孢杆菌是一类好氧产芽孢的革兰阳性杆状细菌,无荚膜,有鞭毛,能运动,广泛存在于土壤、湖泊、海洋和动植物的体表,无致病性[5]。由于枯草芽孢杆菌具有生长速度快、营养简单以及耐热、可产抗逆芽孢等突出特征,在微生态制剂生产加工等环境中的易存活、定殖与繁殖,成本较低,施用方便,储存期长[6],现作为一种无毒、无害、无残留、无抗药性的绿色饲料添加剂重要菌种之一。但目前市场上大多数商品化的作为猪饲料添加剂的枯草芽孢杆菌都是从泥土和草地等自然环境中分离出来的,要想筛选出作为猪的饲料添加剂理想的菌种,应优选来源于猪肠道,经过与猪共生长期驯化的枯草芽孢杆菌,才能够更好地适应猪体内环境、发挥更好的效果[7]。

本试验对从健康猪肠道内容物、新鲜粪便及猪场周边土壤中芽孢杆菌,进行菌落形态观察、生理生化特征和16S rRNA 序列分析及同源性比较,研究了其生物学特性,以期得到高生物活性的益生菌菌株,为猪微生态饲料添加剂的开发提供候选菌株。

1 材料

1.1 样品来源 采自江西赣州、上饶等地猪场健康猪肠道内容物、新鲜粪便及猪场周边土壤。

1.2 培养基 富集培养基(液体):可溶性淀粉3.0 g,蛋白胨10.0 g,酵母膏3.0 g,磷酸氢二钠2.0 g,磷酸氢二钾1.5 g,硫酸镁0.1 g,去离子水1 000 mL,pH 值7.5,121 ℃灭菌20 min。

分离培养基(固体):葡萄糖5.0 g,蛋白胨5.0 g,酵母膏5.0 g,磷酸氢二钾4.0 g,琼脂粉18.0 g,去离子水1 000 mL,pH 值7.4,121 ℃灭菌20 min。

LB 培养基:氯化钠10.0 g,蛋白胨10.0 g,酵母粉5.0 g,去离子水1 000 mL,pH 值7.5,121 ℃灭菌20 min。

2 方法

2.1 菌株的分离与筛选 菌株的初筛:取新鲜仔猪粪25 g,与225 mL 富集培养基于三角瓶中混合均匀,30 ℃摇床培养过夜,将培养好的菌悬液置于80 ℃水浴锅中处理15 min,然后取出静置冷却,吸取已经进行热处理的培养液1 mL,用灭菌0.9%生理盐水进行梯度稀释至10-5、10-6、10-7三个浓度梯度,每个梯度重复3 次,通过平板涂布法接种于分离培养基上,于30 ℃温箱培养24~48 h。挑取圆形、表面平整、不光滑、无光泽、边缘不整齐的菌落进行扩增培养,培养好后取少量菌液进行革兰染色及芽孢染色观察[8],对疑似菌落进行分离纯化,并将分离纯化好的菌株于-70 ℃冰箱保存备用。

菌株的复筛:将初步分离的疑似芽孢杆菌的单菌落分别点种到淀粉酶筛选培养基、CMC-Na 纤维素酶筛选培养基和干酪素培养基上[9],30 ℃下培养48 h,(1)在干酪素培养基上的菌落周围产生透明的水解圈则表明该菌株具有产蛋白酶能力;(2)在淀粉酶筛选培养基上滴加卢戈氏碘液,观察是否有水解环出现,若菌落周围产生透明水解圈则表明该菌株具有产淀粉酶能力;(3)在CMC-Na 纤维素酶筛选培养基上滴加刚果红水溶液,静置显色30 min 后用蒸馏水洗去多余染液,再加入适量NaCl 溶液静置洗脱30 min,最后再用蒸馏水清洗一次。若产生水解圈则表明该菌株具有产CMC 纤维素酶能力。每株菌株进行至少3 次生物学重复,通过比较测量的水解圈直径大小(HD)和菌落直径大小(CD)的比值(HD/CD)大小,筛选出具有较强产酶能力的菌株[10]。

2.2 菌株的特征鉴定 形态和生理生化特征鉴定:上述分离纯化方法获取疑似芽孢杆菌菌株按常规细菌生化试验,根据革兰染色后菌株形态学的特性,初步选取形态学特征较为明显的菌株(革兰阳性、棒状或短杆状、有内生芽孢)进行生化特征分析[11]。参考《伯杰式细菌鉴定手册》第八版进行鉴定,选择接触酶、糖/醇利用、V-P 反应、淀粉水解、吲哚形成、明胶液化、纤维素水解、蛋白水解、硝酸盐、柠檬酸盐和硫化氢利用试验作为初步判断枯草芽孢杆菌的特征性生化指标[9-10]。

菌株分子生物学鉴定:使用细菌基因组DNA 提取试剂盒(AXYGEN 公司),参考试剂盒说明书进行细菌基因组DNA 的提取。16S rRNA 基因保守序列使用通用引物1492R:5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′和27F:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′进行PCR扩增。25 μL 反应体系:10×Buffer 2.5 μL、模版DNA 1 μL,上下游引物各1 μL,dNTP 2 μL,Taq DNA 聚合酶0.5 μL,加无菌水至25 μL。PCR 条件为94 ℃预变性5 min,94 ℃变性30 s,54 ℃退火30 s,72 ℃延伸60 s,35 个循环。将16S rRNA 扩增片段经过1%琼脂糖凝胶电泳后,紫外灯下观察,并用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(AXYGEN 公司)对目的片段进行回收,对回收后的产物送生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。测序结果在NCBI 使用Blast 比对,从GenBank 数据库中获得与菌株16S rDNA 源的公认标准序列数据,使用Clustal X 1.8 将不同的序列对齐后,使用DNAman 5.1 构建菌株的系统进化树。

2.3 菌株的生物学特性 耐酸试验:取1 mL 菌株培养液加入pH 值3.0 的50 mL 营养肉汤培养基中,37 ℃,120 r/min 摇床培养,于0 h、3 h、6 h 和9 h进行平板计数,计算存活率,设3 个重复。

耐胆盐试验:取1 mL 菌株培养液加入胆盐浓度为0.5%50 mL 的营养肉汤培养基培养,于0 h、4 h 和8 h 进行平板计数,计算存活率,设3 个重复。

产酶能力:淀粉酶活性采用碘-淀粉比色法测定,蛋白酶活性采用福林酚法测定[12],纤维素酶活性采用羧甲基纤维素钠盐(CMC-Na)酶活性测定方法测定[13],脂肪酶活性采用橄榄油乳化液法测定[14]。

3 结果

3.1 细菌的筛选分离 从健康猪肠道内容物、新鲜猪粪便及猪场周边土壤等样品中分离纯化得到的菌株进行革兰染色,选取革兰阳性菌和有芽孢的菌落再做生化鉴定试验进一步验证,参照《常见细菌系统鉴定手册》和《伯杰式细菌鉴定手册》,筛选接触酶、V-P 反应、明胶水解、葡萄糖产酸和硝酸盐利用为阳性的菌株,初步确定了11 株疑似芽孢杆菌,分别 为GZ-0107、GZ-0183、FU-037、SR-096、MR-0302、GT-067、GT-082、GT-0126、GT-53、GT-0213 和WI-074,其结果见表1。

表1 菌株的生化鉴定结果

将初筛获得疑似芽孢杆菌分别点种于淀粉酶、纤维素酶和蛋白酶筛选培养基上,培养48 h 后,测量不同筛选平板上单菌落的直径(CD)和水解圈或透明圈的直径(HD),通过比较HD/CD 的比值来判断不同菌株产酶能力的大小。从表2 可以看出,能够同时表现出淀粉酶、纤维素酶和蛋白酶的菌株共有8 株,MR-0302 只表现出淀粉酶酶活,GT-0126 和GT-0159 没有表现出纤维素酶活,而GZ-0107、GZ-0183 和SR-096 这3 株菌具有较为明显的高产淀粉酶、纤维素酶和蛋白酶的综合能力,尤其是SR-096菌株,其综合产酶能力最为突出。

根据上述生化特征分析及产酶能力分析结果(见表1 和表2),选取8 株菌株,即GZ-0107、GZ-0183、FU-037、SR-096、GT-067、GT-082、GT-0213 和WI-074,16S rRNA 基因测序结果呈送GenBank 数据库中收录,收录号分别为KP834902、KP834901、KP834904、 KP996671、 KP834899、 KP834898、KP834895 和KP834900。以16S rRNA 基因BLAST进行序列同源比对及系统发育树,如图1 所示,结果表明,FU-037 和WI-074 位于腊样芽孢杆菌大分支中,FU-037 与蜡样芽孢杆菌(B.cereus)KJ722447 的相似性为 99.2%,WI-074 与蜡样芽孢杆菌FJ210679 的相似性为99.1%;GZ-0107、GZ-0183、SR-096、GT-067、GT-082 和GT-0159 位于枯草芽孢杆菌大分支中,其中GZ-0183 与枯草芽孢杆菌KJ957013 的相似性达到99.6%。综合生化特征和分子鉴定结果,认为FU-037、GT-0213 和WI-074 为腊样芽孢杆菌,GZ-0107、GZ-0183、SR-096、GT-067和GT-082 为枯草芽孢杆菌。

表2 芽孢杆菌产酶能力测定结果

图1 芽孢杆菌的16S rRNA 基因系统发育树

3.2 菌株生物学特性分析

3.2.1 耐酸耐胆盐试验 从图2 可看出,不同菌株间耐酸性存在较大差异,pH 值3.0 的环境下处理3 h 后GZ-0107、GZ-0183、SR-096 和的存活率分别为58.7%、77.2%、89.2%:处理6 h 后分别为41.7%、38.4%、82.5%;处理9 h 过程中,GZ-0107 存活率下降最明显,SR-096 存活率仍在70%以上,耐酸能力明显优于另外两株菌。

由图3 结果可知,在高浓度胆盐处理2 h 后GZ-0183 的存活率为51.9%;处理8 h 后SR-096、GZ-0183 和GZ-0107 的存活率分别为46.7%、14.7%、19.8%。SR-096 在高浓度胆盐处理后仍有以上的存活率,具有较强的耐胆盐能力。

图2 不同菌株间的耐酸性比较

图3 不同菌株间的耐胆盐比较

3.2.2 产酶试验结果 由表2 可以看出,菌株SR-096、GZ-0183 和GZ-0107 都可产淀粉酶、蛋白酶和纤维素酶,不同菌株产酶种类和能力不同。对于3株枯草芽孢杆菌,蛋白质水解环直径横向比较差异不显著,但在在培养28 h 后,SR-096 蛋白质水解环直径都显著大于GZ-0107,GZ-0183(P<0.05);反映其产淀粉酶能力的染色圈直径/菌落直径(HD/CD)上发现SR-096 和GZ-0183 的水解环直径显著大于GZ-0107(P<0.05);反映其产纤维素酶能力的(HD/CD)及产脂肪酶能力的(HD/CD)数值上均为SR-096 最高,但菌株之间差异不明显,说明菌株SR-096 具有较好的产淀粉酶、蛋白酶和纤维素酶能力水平。因发现平板法HD/CD不能完全代表菌株产酶能力,所以对产酶菌株进行发酵液法胞外酶产酶活性测定是非常必要的。由表3 可以看出,菌株SR-096 产蛋白酶和淀粉酶活力显著高于菌株GZ-0107 和GZ-0183、在纤维素酶和脂肪酶活力只是在数值上较高,与初筛结果基本一致。

表3 不同菌株发酵液的胞外酶活性 (U/mL)

4 讨论

微生态制剂在生产过程中一般把筛选益生菌作为关键的一步,因为种属特异性是筛选合适益生菌的一个先决条件,不同来源的芽孢杆菌在不同动物胃肠道内的粘附繁殖能力及相关生理功能有所不同[15]。本试验菌株是从猪肠道内容物、粪便、土壤等中分离纯化,先通过传统方法对分离出来的菌株做菌落形态观察、染色镜检和生理生化检测,然后运用16S rDNA 核酸序列分析及同源性比较进行菌株鉴定,这样可以最大程度地保证结果的准确性和客观性。试验中分离出在菌落形态和生理生化特性与标准枯草芽孢杆菌基本吻合的疑似菌株11株,其中8 株能够同时表现出产淀粉酶、纤维素酶和蛋白酶能力;16S rRNA 核酸全序列测序和同源性比对分析发现有5 株与枯草芽孢杆菌的同源性最高,达到99%以上。经细菌的菌落形态观察、染色镜检、生化试验以及16S rRNA 序列分析及同源性比较,综合确定菌株SR-096、GZ-0183 和GZ-0107 为枯草芽孢杆菌。

枯草芽孢杆菌作为益生菌,因枯草芽杆菌在缺乏营养或不良环境时,通过生成内生孢子来增强抵抗肠道逆境条件,而表现出耐胃酸、耐胆盐、耐加工、耐储藏、稳定性等特性,还具有分泌淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶和脂肪酶的能力[16]。这些外源性的消化酶,参与动物消化道的酶池,在一定程度上帮助降解动植物性饲料中复杂的有机物,促进营养物质的消化吸收,提高饲料利用率。因此,芽孢杆菌作为益生菌制剂开发应用的潜力很大。本试验采用平板透明圈法结合胞外酶活性测定,对枯草芽孢杆菌产淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶和脂肪酶情况进行分析,初步反映出产酶活力的高低,产酶能力越高,水解圈越大;产酶速度越快,水解圈出现的越早。培养液法胞外酶产酶活性与平板透明圈法反应的酶活基本一致。其中枯草芽孢杆菌SR-096 产淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶和脂肪酶能力的表现较为显著,具有较高的综合产酶能力,其可以在畜牧养殖中用来高效转化饲料中的淀粉、蛋白质和纤维素,这为今后将其应用于生产实践提供了重要的理论依据。