文化遗产微生物研究方法进展

武发思，苏敏#，田恬，汪万福,2,3,4，冯虎元*

(1. 兰州大学 细胞活动与逆境适应教育部重点实验室，甘肃 兰州 730000；2. 敦煌研究院 国家古代壁画与土遗址保护工程技术研究中心，甘肃 敦煌 736200；3. 古代壁画保护国家文物局重点科研基地，甘肃 敦煌 736200；4. 甘肃省古代壁画与土遗址保护重点实验室，甘肃 敦煌 736200)

文化遗产是指具有历史、艺术和科学价值的文物。文化遗产类型多样，主要包括历史文物、历史建筑和人类文化遗址等,其构成材料千差万别，但微生物几乎可以作用于任何材质的文化遗产，造成其污损、退化甚至降解[1]，因此微生物对文化遗产的作用形式体现在多个方面(表1)。大多文化遗产和历史建筑物长期暴露在环境污染、化学处理及多变的气候因素之中，这促进了微生物的定殖和生长代谢,导致其在物理结构、化学组成或美学特征方面发生不可逆转的改变和损伤(图1)，通常称之为生物退化[2]。对于文化遗产系统科学的分析可以追溯到20世纪80年代，20世纪初已有地衣和植物体导致历史纪念碑生物退化的相关报道[3]，早期针对文化遗产生物退化的大多数先驱研究都总结发表在了1991年的《国际生物退化和生物降解》特刊上[4]。从研究方法上来看，传统的纯培养方法在研究文化遗产微生物类型、生长和代谢活动中被普遍使用，而由于该方法在微生物群落结构及多样性等研究中的自身局限性，促使研究人员不断探索更为复杂和高效的方法与技术，如近年不断更新的成像技术、分子生物学技术和组学相关的代谢分析技术等。我国在文化遗产微生物学领域的研究目前尚处于探索发展阶段，存在研究方法传统单一、对微生物学中涌现的新技术应用滞后、研究的系统性和连续性不强等突出问题。随着全球气候变化加剧、极端天气频繁发生、环境污染日益加重以及旅游业的高速发展，文化遗产保护中面临的微生物问题日益凸显，开展深入研究的需求十分迫切。为此，本文以文化遗产微生物病害及其防治研究方法为主线(图2)，探讨了国内外相关方法技术的应用范围和已取得的最新进展，以期为相关学者在研究方法与技术选择及研究路线设计中提供借鉴，同时推动我国文化遗产微生物学研究领域向前发展。

表1 文化遗产微生物退化与降解相关术语

图1 文化遗产的生物退化、生物风化及生物污损Fig.1 Biodeterioration, bioweathering and biofouling of cultural heritage

a: 敦煌莫高窟古代壁画的微生物退化; b: 咸阳乾陵石质文物的生物风化; c: 柬埔寨吴哥窟遗址的生物风化; d: 洛阳龙门石窟石质造像的生物污损; e: 南昌海昏侯墓车马陪葬坑的生物污损

a: Microbial deterioration ancient wall painting of Mogao Grottoes; b: Bioweathering of stone relics of Qianling Mausoleum; c: Biodeterioration of Angkor Wat in Cambodia; d: Biofouling of stone statue of Longmen Grottoes in Luoyang; e: Biofouling of burial chariot pit around the tomb of Haihonghou tomb in Nanchang

图2 文化遗产微生物主要研究方法与技术框架Fig.2 The mainly framework of methods and techniques for cultural heritage microbial research

1 传统基于培养的方法

纵观多数环境微生物的研究历史，现有知识主要来源于基于培养的方法。要研究文化遗产微生物，首先需要对出现在遗产材料上的微生物进行表征和鉴定。在实验室条件下培养微生物，并维持和控制其生长，是开展不同类群生长和代谢特征研究最直接和最有效的方式。基于培养的技术包括通过利用富营养培养基、选择性培养基或寡营养培养基，对菌株进行富集和分离纯化，其中富集培养应用较为广泛。分离得到的纯菌株可以表征其生理生化等方面特性，因培养条件下的任何改变都可以直接归因于菌体的生物学过程。表2对文化遗产微生物研究中常见术语和技术的缩略词和释义进行了汇总。

Ikner等[7]在对亚利桑那州卡特那洞穴的研究中，用无菌棉签蘸取无菌水擦拭有涂料的玻璃纤维和岩石表面，培养分离获得纯培养菌株，并利用16S rRNA 的PCR扩增和测序技术鉴定了90个特定菌株。本课题组近年通过空气微生物采样、分离培养和测序等技术对敦煌莫高窟洞窟内外空气细菌[9-10]与真菌[11-12]浓度和多样性的时空变化特征进行了研究，并对搬迁复原保存于甘肃省博物馆的嘉峪关魏晋五号墓内外空气微生物进行了比较分析[13]，研究结果为石窟与墓葬环境空气质量评估及旅游开放提供了重要依据。

微生物学家在过去10年中引入了一些旨在满足微生物生长需求并能更好地模拟其自然条件的创新技术，试图通过调节培养基中微量元素和改变培养条件来获得新菌株。模仿自然条件可以提高培养新菌株的成功率，但这种方法的效率却很低[14]。而通过研发的选择性培养基富集具有生物矿化功能的本土微生物，已被证明可用于风化石质文物的加固和保护[15]。

表2 缩略词及其释义

2 表观形态学方法

表观和形态学方法指涉及视觉和微生物物理外观等方面的研究方法。环境样品微生物的可视化及其活性研究长期以来是微生物多样性研究中的重要内容。显微技术常常依赖于基于培养的方法，对微生物样本的微观检查是开展更为复杂研究的基本步骤。

2.1 显微镜技术

2009年，Santos及其同事[16]使用扫描电镜-能谱分析仪(SEM-EDX)、环境扫描电镜(ESEM)和荧光原位杂交技术(FISH)检查了西班牙托莱多大教堂基督十字架油画。分析表明：细菌和真菌的生物膜结构与壁画颜料层紧密结合；SEM-EDX分析在描述颜料与微生物群落间的相关性方面发挥了重要作用。例如，细菌是铜基颜料的主要污染物，并且在朱砂中的丰度低，在这两类颜料中也存在少量真菌。同年Cappitelli 等[5]对意大利圣布里齐奥教堂中路加·西诺雷利壁画上的玫红色斑点进行了全面研究，通过光学荧光显微镜和扫描电镜(SEM)检查了斑点中是否存在微生物及其大小和分布，发现形成生物膜的微生物细胞主要是直径大于5 μm的球形细胞，样本的自发荧光信号结果呈阳性，而扫描电镜分析显示囊状球菌细胞占主导地位。

Coutinho等[19]发表过关于一幅20世纪20年代后期釉面瓷砖上微生物的研究报告。光合微生物在艺术瓷砖上定殖，并影响釉面表现出部分剥落现象。作者使用LM识别了其中的部分微生物：两种绿藻，一种真菌和一些不发达的地衣，使用此技术揭示了地衣演化过程的第一阶段，并使用场发射扫描电镜(FESEM)来确定表面形貌、微生物形态和分布及其与基底材料的关系。FESEM图像呈现了玻璃表面和材料内部的生物膜，及胞外聚合物(EPS)对丝状生物的黏附力。激光共聚焦扫描显微镜(CLSM)的使用实现了对瓷砖上生物膜的生物学表征，其主要由细菌、蓝藻、微型藻和一些地衣组成，从而证实了LM的观察结果；而荧光模式的CLSM显示出了光合色素和用刀豆球蛋白A鉴定的EPS小斑点，使用CLSM获得的3D图像还可用来确定生物膜结构并测量其厚度。同样，Cennamo及其同事[20]使用LM和SEM确定了生长在意大利那不勒斯历史遗址黄色凝灰岩上的由蓝藻和其他藻类形成的光合生物膜，利用SEM观测证实了生物膜与石质底物间的联系，并表明蓝藻紧密黏附在凝灰岩上，而其他藻类则分布在其表面。Jrondi等[15]利用SEM-EDS、TEM和原子力显微镜(AFM)等从纳米尺度上表征了产碳酸细菌群落的微生物矿化进程和产物特征。本课题组近年使用SEM技术对存在于莫高窟、天梯山和麦积山壁画彩塑上的微生物形貌特征进行了分析研究，确定了菌体的存在形式、分布特点及其菌丝生长对壁画结构的影响[21-23]。显微镜成像技术在文化遗产生物学研究中的应用将会更为广泛和深入。

2.2 光学荧光和光谱技术

真菌可对多种文化遗产材料造成侵蚀，对真菌污染进行清除的成本很高，且可能造成新的损伤，常见微生物生物量检测方法昂贵又耗时。因真菌生物量与荧光强度成线性关系，荧光测定法被用来检测真菌对文化遗产材料的破坏性，以及材料表面是否使用过其他化学成分和溶液。Konkol等[24]对一种简单的荧光测定方法进行了微调，用于检测如纸张、帆布和大理石基质等各类文物上的真菌生物量[25]，这种能在45 min内完成的快速荧光测定的方法可检测到早期生长在纸质文物上的真菌，从而帮助图书档案管理人员有效地保护资料，或及时制定补救措施。对该方法的进一步改进[26]，使其成为在无法应用其他复杂检测设备时的一个最佳选择，因其只需一个紫外灯在很短时间就可完成测定，通过成像软件(如常用于扫描琼脂糖凝胶的软件)进行半定量和荧光量测定。

在对西班牙花岗岩类石质文物的研究中，Sanmartín等[27]通过微调花岗岩远程色彩测量方法，成功测定了6个商业品种的颜色，这表明数码相机和图像处理技术在色彩测量装置中的应用已越来越多。Coutinho等[19]对艺术瓷砖损坏现象的研究中，运用数字图像分析技术确定了生物膜的覆盖面积，根据此方法对定殖在釉面不同的真菌图像数据进行主成分分析(PCA)，以识别生物污染区域。Jrondi等[15]通过拉曼光谱(Roman spectrum)验证了细菌矿化过程中方解石的生成。荧光和光谱技术今后必将在文化遗产图像信息提取[28]和微生物病害研究中具有更为广阔的应用。

3 分子生物学方法

近年来，分子生物学相关方法和技术在揭示文化遗产微生物退化机制中发挥了重要作用，相关技术为鉴定、表征和描述微生物多样性打开了新的大门。现代生物学技术和仪器可在更大范围内揭示生物膜中隐藏的微生物多样性信息。同时，分子生物学在研究微生物功能方面已推动了医学和环境生物学等不同领域的重大发展。然而，分子生物学方法在文化遗产微生物学研究中应用的时间还不长。与培养方法相比，分子技术相对快速和可靠。在过去10年中，许多基于核酸的技术被广泛用于微生物群落分析，DNA和RNA检测和分析方法在文化遗产的生物退化研究中取得了较大进展。随着如基因组学、蛋白组学和代谢组学等生物信息学技术的进步，微生物生态学研究的广度和深度必将大大增加。微生物响应其所处环境所产生的代谢物的分析可为微生物功能研究提供有用的途径，宏基因组学和高通量测序的快速发展使得这些方法更易于在多种环境中使用，其不仅可以表征微生物多样性，还可以更好地了解微生物群落在自然环境中的功能、活动特征及其动态[29-31]。

3.1 基于核酸分析的方法

目前，该领域的研究者可以充分利用分子技术，以不依赖于培养的方式对原位微生物进行高灵敏度的检测和鉴定，还可以利用电子显微镜之外的各种物理和化学表征方法，实时和三维分析微生物与底物间的相互作用。在20世纪80年代和90年代，PCR作为一项革命性的技术，能够在不需要培养的条件下，定性检测和定量分析不可培养微生物及整个复杂的群落结构特征。

以核酸为基础的各类方法都是基于rRNA或其他基因片段的PCR扩增，再采用变性梯度凝胶电泳(DGGE)或克隆文库构建和测序；rRNA是目前在微生物分子鉴定中最为有用以及应用最广泛的分子标记，由于其功能上高度保守，序列上包含可区分分类群的高变区；细菌和古菌16S rRNA基因(或18S / 28S rRNA基因/真菌的基因内转录间隔区(ITS)区域)是识别的首选基因，而基因数据库已发展到可以鉴定到物种的精确度。

在罗马尼亚17世纪木质教堂的微生物研究中，Lupan等[32]利用培养和分子技术分离并鉴定了木材上细菌和真菌群落的变化。基因检测方法相比传统鉴定方法更为省时，而传统培养和观察菌丝及孢子形态的鉴定手段一般需要数天至数周时间。对列入世界文化遗产的智利18至19世纪奇洛埃木制教堂也进行过类似研究[33]，在木材中检测到了白色、棕色和软腐真菌；通过ITS区测序确定了大量木腐真菌，其中一些种属在智利是首次被报道。Kusumi等[34]研究了柬埔寨12世纪巴戎寺砂岩的生物膜形成，使用PCR扩增后用DGGE对生物膜中群落组成进行了分析。DGGE技术的优点源于单个条带容易分离后构建克隆文库，再测序鉴定，条带的浓度可以反映出类群的丰度。另一项研究调查了巴戎寺真菌及其在群落演替中的作用[35]，通过分离真菌菌丝体、PCR扩增、ITS区域测序及β-tubulin基因分析完成了真菌鉴定，使用两个独立的基因使鉴定更为准确。Kusumi等[34]选用DGGE技术区分石材上生物膜的空气来源，通过克隆文库技术鉴定了生物膜样品常见的种属。

我国研究者应用PCR-DGGE技术对云冈石窟石质文物样品中微生物群落结构进行过分析研究[36]。吴明辉等[37]回顾了石生微生物的分类、分布、研究方法、生态适应等方面的研究进展，并探论了其与石质文物保护间的关系。在对莫高窟壁画微生物研究中，本课题组运用PCR、克隆文库和测序技术鉴定了壁画表面白色菌斑中的细菌群落组成[21]；通过采用培养和分子方法研究了石窟可培养微生物在不同pH，盐度和温度范围内的生长；使用相关性分析发现真菌群落与洞窟的建造年代相关[38]。

以上研究都是根据常规PCR，仅能提供定性结果。而通过定量PCR(qPCR)进行定量分析则更为有趣，该测定可基于标准曲线评估模板的浓度。Meng等[39]使用实时荧光定量反转录PCR方法比较了吴哥窟巴戎寺4个位点氨氧化古菌(AOA)和氨氧化细菌(AOB)的丰度，发现AOA基因丰度明显高于AOB，这两类功能菌群在氮循环中发挥着重要作用，其活性影响产酸过程并导致砂岩劣化。Kraková等[40]使用功能基因表征了博物馆木质和纸质文物上的真菌，运用可预测纤维素分解活性的基因引物，即纤维二糖水解酶I(cbh I)，并通过cbhI和ITS区鉴定分离的真菌，此类功能基因可用于表征微生物活性及其对文化遗产侵蚀能力的评估。根据对罗马地下墓穴的研究，Krakova等[41]建议同时使用多种方法；虽然分子方法可快速获得微生物多样性的可重复数据，但如果没有培养的菌株，就很难研究材料劣化的生物化学过程。

基于核酸的分子方法优势明显，不需培养从而节省时间，并可获得大量微生物信息，检测敏感度更高。其局限性在于不能对代谢潜能做出判断，虽然基因功能预测方法正在快速发展，基于mRNA的基因表达预测今后将更为普遍。

3.2 荧光原位杂交技术

荧光原位杂交技术是根据已知微生物不同分类级别上种群特异的DNA序列，以利用荧光标记的特异寡聚核苷酸片段作为探针，与环境样品基因组中DNA分子杂交，然后通过荧光显微镜或激光共聚焦显微镜直接观察和定量该特异微生物种群的存在与丰度[42]。具有不同荧光团的多个荧光探针可应用于同一样本，以便同时观察多个类群。由于荧光原位杂交(FISH)靶向rRNA转录，只有足够核糖体数量的活性微生物体才会产生强烈的荧光信号。

May等[43]已讨论了荧光原位杂交技术在细菌生物退化中的作用。González-Pérez等[44]近期开发了一种RNA-FISH双染悬浮法用于细菌和酵母的瞬时检测，该技术可以证实那些直接参与文化遗产生物退化的活性微生物，通过RNA-FISH悬浮法，利用流式细胞仪(Flow cytometry)分析微生物群落也会成为可能。将这一技术应用到葡萄牙阿伦特霍埃斯库尔洞旧石器时代考古遗址上样品的检测，并深入讨论了探针标记荧光染料对分析结果的影响。

3.3 新兴技术和生物信息学工具

近年来，新一代测序(NGS)技术被应用于单个生物体全基因组研究，尤其是宏基因组学，已成为深入了解微生物多样性的重要工具。全新的DNA测序技术能同时对几十万甚至几亿的DNA分子进行平行测定，与传统测序技术相比具有高通量、高敏感性等优势，因此被称作“高通量测序技术”，是对传统Sanger测序的革命性改革。随着技术成熟，费用降低和实验周期缩短，使其大量应用于临床诊断和科学研究及单一生物的全基因组研究，实现了对各类环境样品的深入测序和数据分析。

Vasanthakumar等[45]使用454焦磷酸测序研究了埃及图坦卡蒙墓壁画上的微生物群落，为壁画棕色菌斑的形成机制提供了重要证据。虽然下一代测序在文化遗产领域仍属新的技术，但它是当前微生物群落分析的最佳选择。本课题组应用Illumina Miseq高通量测序技术对天水麦积山石窟和武威天梯山石窟壁画微生物进行了全面研究，评估了壁画病害菌群落结构特征及其劣化过程[22-23]。其他学者，如Xu等[46]运用高通量测序技术研究了考古埋藏环境中细菌多样性和群落分布；Li等[47]运用该技术分析了石质文物上微生物群落，讨论了微生物诱导的碳酸钙沉降。

生物信息学工具已普遍应用到文化遗产微生物学研究中，如16S rRNA的系统发育树分析，BLAST-NCBI数据库的同源性检索分析[8]，以及运用MEGA软件建立系统发育树，如邻接法(NJ)[48]、最大似然法(ML)和最大简约法(MP)等[49]。

高通量平台的选择目前更加多样化。Adamiak等[50]首次利用半导体芯片测序技术平台(PGM，Ion TorrentTM)调查了波兰罗兹19世纪砖石质历史建筑上参与生物退化的细菌、古菌，尤其是嗜盐微生物的群落结构，并讨论了因引物选择造成的结果偏离。毫无疑问，新兴技术和生信分析工具在未来10年将会有更多突破和发展，这对于促进文化遗产微生物退化及其防治有重要意义。

4 生物化学分析

利用生物化学分析手段，通常可检测到原位微生物的活力，并判断因微生物生长增殖和代谢活动对文化遗产材料造成的可能侵蚀、退化和危害。

4.1 ATP测定法

三磷酸腺苷(ATP)生物发光测定法是一种用于确定微生物活力的较为敏感的方法。Rakotonirainy等[51]应用这种方法对书籍中的斑点进行了成功检测，通过分别检测书本斑点区和无斑点区，无斑点区没有检测到ATP。但这种方法是有损分析，必须将纸张样本切下来，因此该方法不太适用于文化遗产微生物常规检测。在对17世纪的羊皮纸手稿的研究中，Troiano等[52]通过显微镜观察和ATP分析，显示微生物污染水平很低，表明其变色与当前活跃的微生物关系不大。另外，ATP测定试剂盒主要是针对细菌设计的，在病害菌为真菌时其检测能力明显不足，但ATP法在人为污染的纸张被切碎的情况下能产生可靠数据[51]。ATP生物发光测定结果证实，变色与作为主要损伤来源活性微生物的定殖可能无关。在国内，葛琴雅等[53]利用ATP生物发光法检测了抑菌剂的作用效力，取得了较好的效果。

4.2 酶分析手段

微生物在环境中的重要功能可通过测定酶的方法确定，蛋白质分析可用来检测微生物活性，如常见酶测定的方法已应用很多年，但在文化遗产微生物学中的应用却很有限。

与微生物相关的酶，如在纸质材料上，常存在可降解纤维素的微生物且具有代谢活性。纤维素酶可由真菌产生并在纤维素底物上表达。Bergadi等[54]研究了分离自古代手稿上的真菌的纤维素酶活性及其对滤纸的降解能力，通过使用含羧甲基纤维素(CMC)的培养基，用半定量方式筛选真菌纤维素分解能力，并使用滤纸来定量测定其酶活性，这一指标是通过分析在适宜条件下真菌对滤纸作用时释放的还原糖的量来计算的，称其为滤纸酶活(FPU)。Hu等[38]研究发现，从巴戎寺砂岩中分离的曲霉属真菌在体外表现出较高的纤维素降解能力，主要测定了纤维二糖水解酶，半乳糖苷酶和其他纤维素酶。有趣的是，真菌在形成生物膜的区域生长可能通过酶活性消除生物膜，即真菌可能在去除石材表面生物膜方面发挥重要功能。

此外，一些参与氮或硫循环的酶在体外也较容易研究。如Villa等[55]分析了古墓石灰石上微生物对于硫污染的响应，测定了负责硫代谢的酶，特别是其基因转录水平较高的酶。酶分析是微生物生态学研究中的有力工具，蛋白质组学的进步增加了酶谱研究的易用性，色谱和质谱技术则提供了极好的灵敏度。随着大型数据库的公开，这些优越的方法正变得更具吸引力。

4.3 代谢物分析方法

微生物代谢产物可为微生物生态学研究提供证据。微生物次级代谢产物，因其具有的各种性质在历史上被广泛关注。如链霉菌和青霉菌产生抗菌化合物以抵御其他微生物；另一类次级代谢产物包括色素，如吩嗪(由假单胞菌属 (Pseudomonasspp.) 和链霉菌属(Streptomycesspp.) 产生)，已被证明在微生物存活和适应性中起到关键作用[56]。

文化遗产上微生物代谢产物检测相对容易，一旦发现黑色素或有机酸，将有助于设计用于微生物分离的特定培养条件。而通过气相色谱/质谱(GC/MS)和基质辅助激光解吸离子化飞行时间质谱(MALDI-TOF)等方法也为代谢物分析提供了巨大的潜力。Kirby等[57]使用多肽质量指纹图谱(一种小分子分析方法)，鉴定了文化遗产上的胶原材料。该方法具有简单、快速、灵敏和具体等优势。Vasanthakumar等[48]使用GC/MS对图坦卡门墓壁画上棕色斑点分析发现，棕斑中的苹果酸(一种常见的微生物代谢物)及其形成与青霉菌代谢有关。色谱和质谱方法目前仍处于快速发展阶段，并成为蛋白质组学和代谢组学方法的基础。这些方法已经成为微生物学研究的主流，因此将很快成为文化遗产研究中有用的方法。

另外，Corsaro等[58]使用质子高分辨率魔角旋转(HR-MAS)核磁共振(NMR)技术分别检测了古代和人工老化手稿中纤维素降解的代谢物，并检测到了纤维中的低分子量化合物。该研究的一个主要目标是展示这种技术对文化遗产对象研究的价值。Rosa等[59]最近利用核磁共振和表面增强拉曼光谱(SERS)研究了分离自法国拉斯科洞穴史前岩画上两株微生物新种(Ochroconislascauxensis和Ochroconisanomala)产生的黑色素结构，其对岩画造成了严重污染。上述研究凸显了代谢物分析方法的最新进展，此类方法有望为文化遗产微生物生理生态学研究提供可靠数据。

5 生物防治方法

生物防治指使用生物杀灭剂及相关产品进行微生物消除，或利用活生物体及产物清洗或清除污染物。在这两种情况下，该过程必须尊重艺术品材料的物理化学性质及其美学外观。

5.1 生物清洗方法

然微生物通常对建筑材料和结构有负面影响，但越来越多的证据表明，它们也可以用作生物清洗过程中的清洁剂[60-61]。在20世纪80年代末至90年代初，微生物在文化遗产的修复或清洁过程中发挥了积极的作用。目前，随着新型微生物技术的发展，文化遗产的生物清洗和生物修复得到了新的关注。

砂岩表面生物膜对基底材料的完整性是有害的，它们是造成砂岩破坏的主要生物因素。Hu等[38]对巴戎寺的研究中观察到真菌在先前由自养和异养微生物定殖的区域形成了致密的生物膜，导致石材表面变黑；这些真菌可以清除模拟的生物膜，将这种具有去除生物膜能力的真菌进行鉴定确定为曲霉属真菌(Aspergillusallahabadii)，其具有应用潜力。Valentini等[62]研究中，基于葡萄糖氧化酶的新型生物清洁流程已用于石灰华和白榴拟灰岩以去除生物膜；用作模型酶系统的葡萄糖氧化酶能在室温下酶促反应中原位产生具有氧化特性的清洁剂过氧化氢(H2O2)，就其清洁效果和表面蚀刻程度而言，石灰华样品的效果更好，可能是因为两种石材的孔隙度不同。使用基于饱和碳酸铵溶液、EDTA缓冲溶液和酶脂肪酶处理的传统方法相比，葡萄糖氧化酶的清洁方法效果最好，可能是因为酶根据孔隙率优先控制H2O2的浓度并且将H2O2保留在存在生物斑的地方。与其他酶(如脂肪酶和蛋白酶)的协同作用，可以提高清洁效率以应用于不同材质。

2011年，Gioventù等[63]将生物清洗技术与化学和激光清洗相比较，认为生物清洗方法在去除石材硫酸盐时能得到最好效果。Lustrato等[64]对位于意大利米兰纪念园湿壁画进行了清洗，该壁画因第二次世界大战进行移除，保护工作包括清除早期修复过程中残留的酪蛋白和动物胶，并将绘画重新粘贴到更合适的支撑体上；通过将施氏假单胞菌(Pseudomonasstutzeri)A29菌株的整个活菌细胞快速施用于壁画表面2 h，并使用分析热解来评估生物清洗的有效性。短期和中期微生物监测证实，活细胞在生物处理后不存在于壁画中，且没有任何可能存在由于代谢引起的潜在负面影响，即该方法安全、环保、无风险。Jrondi等[15]指出基于微生物矿化的石质文物加固技术，并从纳米尺度上表征了产碳酸细菌群落的微生物矿化进程和产物。这种生物清洗工艺的成本相对较低，代表了一种极具竞争力，低成本高效益的解决方案。

Troiano等[65]展示了将化学和生物处理与石材艺术品清洁相结合的协同效应。在该研究中，建立了一种运用生物学方法来清除壁画中由石膏、花岗岩、碳酸钙、磷灰石、硝酸盐和老化蛋白质物质组成的黏附沉积物。所选细菌非孢子形成菌株，含有微生物的代谢浓缩物用于原位生物清洁测试显示，清洁后不会有任何残留物，清洗修复方法成功。我国文物保护工作者对丝织文物的生物技术清洗、微生物注浆加固砖石砌体，及生物技术在文物保护中的应用也进行了有益的探索和讨论[66-68]，为相关技术的应用提供了参考。

5.2 生物杀灭方法

在使用一种杀菌剂或相关产品前，必须充分研究目标菌落的微生物生态学特征。近年来，寻找天然杀菌剂也成为一种趋势[69-70]。使用拮抗生物体或其代谢产物为生物防治提供了新思路，其具有对人体健康无害、环境影响小、选择性高、成本低廉等优势。

Cappitelli等[5]测试了两种生物杀菌剂对奥维多大教堂壁画上蓝藻的杀灭能力，使用ATP检测法证明其中一种(Metatin)效果更好。已知的许多植物精油亦具有抗微生物活性，Jeong等[70]提出了利用生态友好型丁香油酚防治韩国和老挝石质文化遗产上地衣和生物膜的新方法，取得了较好的效果。Borrego等[71]利用通过蒸馏获得的精油，使用琼脂扩散法分析了其对4种真菌和6种细菌的抗菌活性；发现茴香和大蒜油在所有浓度下均显示出最好的抗真菌活性，而牛至油还能抑制真菌形成孢子；但甜橙精油和月桂油对真菌无效。丁香、大蒜和牛至油对成团肠杆菌(Enterobacteragglomerans)和链霉菌(Streptomycessp.)有最佳抗菌活性，而只有丁香和牛至油对芽胞杆菌(Bacillussp.)有效。我国学者也对植物精油化学成分及其抗菌活性的研究进展进行了评述[72]。同时，基于传统杀菌剂和ZnO、TiO2等纳米材料的杀菌方法在近年快速发展并在多类文物上得以应用[73-74]。杀菌剂的时效性是保护工作者最为关注的问题之一，一项长达8年的监测研究表明，经加固剂和杀菌剂(包括铜纳米粒子)处理意大利佛罗伦萨一处考古遗址不同类型石材后，微生物膜是否会再建殖主要是由石材本身的生物易感性和当地气候决定的[75]。这些研究对于利用植物天然产物和纳米材料控制文化遗产微生物病害具有重要意义。Cennamo等[20]研究了在意大利那不勒斯历史遗址黄色凝灰岩上的光合生物，通过光学、电子显微镜和分子生物学技术鉴定发现蓝藻是生物膜的主要成分；通过采用射频非致热效应的新技术，暴露于射频电磁场7 d后，生物膜减少了约50%，处理1个月后生物膜完全消失，并且在6个月后没有再生。Mascalchi等[76]激光清洗配合微波方法能够有针对性、高效、安全地清除石面生和石内生生物病害体。Calvo等[77]讨论了γ射线在纸质文物病害真菌防治中的应用。姚娜等[78]讨论了纸质文物防霉、除霉保护技术，并利用纸浆修复方法对霉变文物进行修复实验。此类传统的物理方法配套新型生物杀灭技术，将在文化遗产生物防治中发挥重要作用。

6 问题与展望

文化遗产微生物研究的主要目的是为了鉴定和判断它们的退化潜力，并减少其对文化遗产造成破坏。本综述介绍并举例论证了文化遗产微生物研究中已使用的主要方法及其适用性，但这些方法各自也存在一些缺点。如基于培养的方法在很大程度上筛选限制了潜在的微生物类群，这类方法仅能获得当前微生物多样性的有限部分。基于核酸的分析并不能获得关于微生物代谢潜能的信息，因此不能作为微生物群落表征的唯一方法；与其他方法相比分子方法有其优越性，但因扩增偏好性引起的偏差不容忽视，该方法对操作过程技术要求较高，且费用高昂。就采样而言，无损的非侵入性采样，其内在局限性是不能收集生长在文物材质内并正与底物发生相互作用的微生物[79]。

新一代测序技术对于提取文化遗产上微生物多样性信息非常有用，其在揭示微生物的功能方面亦具有优势，但将显微镜成像、培养技术、多组学技术和多学科分析方法相结合来评估文化遗产微生物的作用形式及其生理生态功能仍是该领域未来的发展趋势。在大量的检测信息支持下，微生物风险综合管理对于人力和财力相对有限的文化遗产保护至关重要；需要强调的是，预防性保护是当前解决文化遗产微生物退化问题最理想的答案，这就需要找出制约生物退化的关键因子，如水是影响吴哥窟砂岩中微生物和盐分活动的主要因子[80]。因此，涉及预防性保护的研究应最大限度地挖掘已有信息，并应着眼于开发和改进监、检测仪器设备，以推动无损分析技术的应用和基于大数据的预防性保护的发展。尤为重要的是，今后有必要建立从采样到生物学信息分析整个流程的方法规范和标准，增加微生物活性方面的模拟研究，促使研究平台与数据库信息的全球共享[81]，并推进文化遗产微生物学学科建设和专业人才培养，以保护属于全人类的文化遗产并将其传承给下一代。