苁蓉舒痉方对帕金森病模型大鼠纹状体Akt／mTOR信号通路的影响

龙金瑶 ，倪锡森 ，陈剑浩 ，刘 婷，钟佳男 ，唐岚芳，肖绍坚 ，蔡 晶

（1.福建中医药大学中西医结合学院，福建 福州 350122；2.福建中医药大学中西医结合研究院，福建 福州 350122；3.福建中医药大学附属第三人民医院，福建 福州 350108）

帕金森病（Parkinson’s disease，PD）是老年人常见的神经系统退行性疾病之一，本病发病率有逐渐上升趋势［1］，其主要病理变化是选择性中脑黑质多巴胺神经元丧失，纹状体多巴胺神经元含量显著性减少。由于其直接致病原因是多巴胺神经元的丧失即细胞的凋亡，故延缓或减少细胞凋亡成为治疗PD的一个重要手段。本实验通过观察苁蓉舒痉方对鱼藤酮葵花油乳液［2］制备的 PD模型大鼠Akt、P-Akt及mTOR蛋白表达的影响，进一步探讨该方防治PD的作用机制。

1 材 料

1.1 动物 48只SPF级SD健康雄性成年大鼠，体质量（180±20）g，由福建中医药大学实验动物中心提供，实验动物生产许可证号：SCXK（沪）2012-0002，福建中医药大学实验动物中心提供SPF级医学实验动物环境设施，使用许可证号：SYXK（闽）2014-0005。

1.2 主要试剂、药物及制备 苁蓉舒痉方由肉苁蓉、赤芍、制黄精、牡丹皮、丹参等药物组成，由福建中医药大学附属第三人民医院提供。药物制备：将药品混匀粉碎，加入蒸馏水，浸泡30 min，放入药壶中大火煮沸后转为小火再煮30 min，将药汁倒出过滤药渣；反复过滤两次后，将药汁倒入烧杯中，计算出高、中、低、剂量浓缩的比例，将烧杯放入水浴锅隔水进行药汁浓缩（终浓度为0.5 g／mL），将浓缩液置于4℃冰箱中保存。

鱼藤酮葵花油乳液：取鱼藤酮粉末（美国Sigma公司，批号：R8875）加入葵花油（美国Sigma公司，批号：S5007）中，稀释成 1.5 mg／mL的鱼藤酮葵花油乳液，4℃下低温避光保存。

β-actin抗体（武汉三鹰生物技术有限公司，批号：66009-1-lg，稀释比：1∶2 000）；羊抗兔 FITC 抗体（美国 Abcam公司，批号：ab6717）；羊抗鼠 TRITC抗体（美国 Abcam 公司，批号：ab6718）；PTEN抗体（美国 Cell Signaling Techonoligy公司，批号：9188）；mTOR抗体（美国Cell Signaling Techonoligy公司，批号：2983）；SDS配胶试剂盒、BCA蛋白浓度测定试剂盒、RIPA裂解液、ECL显色剂、5×上样缓冲液（上海碧云天生物技术有限公司）。

1.3 仪器 GelDOC 2000型凝胶成像分析系统、电泳槽及转膜仪（美国Bio-Rad公司）；DU-650型蛋白分析仪（美国Beckman公司）；-4℃高速冷冻离心机（德国 Eppendorf公司）。

2 方 法

2.1 PD模型建立及分组 将48只健康雄性大鼠随机分为正常组8只、溶剂组8只、造模组32只。造模组大鼠于头部皮下注射鱼藤酮葵花油乳液，每天注射前先给大鼠称重，按比例注射鱼藤酮葵花油乳液每天0.1 mL／100 g，连续给药14 d，建立PD模型；正常组不予处理；溶剂组相应部位注射葵花油乳液每天0.1 mL／100 g。造模组大鼠出现弓背竖毛，毛色发黄变脏，活动减少，爬壁次数减少的行为（记为1分）以及出现步态不稳或不能直线行走的行为（记为2分）判定为造模成功。把32只造模成功的大鼠随机分为模型组、低剂量组、中剂量组、高剂量组各8只。

2.2 干预方法 按照人与动物体表面积折算（人临床用量为47 g／d）计算出高、中、低剂量组的给药量分别是 10、5、2.5 g／kg，采用苁蓉舒痉方水煎剂定时灌胃，每天1次，灌胃前先称重，按比例灌胃，连续灌胃2周。

2.3 取材及样品的制备 取材之前的12 h大鼠停止进食，麻醉下断头、取脑，分离出中脑纹状体（前囟后5.2 mm，正中线左右侧1.0 mm，硬膜下9.0 mm），用0.9%氯化钠溶液洗净后置于液氮中保存。制备样品时，将纹状体取出后，称量所需纹状体，加入 RIPA 裂解液（1∶12.5 μL）充分研磨，静置 30 min；用移液枪将组织液从研磨管中完全吸出至2 mL离心管中，每管用1 mL注射器吹打20次，放入-4℃冷冻离心机中离心 15 min（12 000 r／min）；抽取上清液加入 5×上样缓冲液（1∶4 μL），置于沸水中 10 min，充分变性后取出含纹状体的混合液（即样品），放入-80℃冰箱中保存备用。

2.4 Western blot检测 从-80℃冰箱中取出样品，置于沸水中充分溶解5min，将样品电泳后，以标准蛋白Mark为参照，根据蛋白分子量切取条带，电转至PVDF膜上；转膜成功后摇床封闭2 h，再分别放入对应 β-actin 抗体（1∶2 000）、PTEN 抗体（1∶2 000）、mTOR抗体（1∶2 000）4℃摇床过夜；用 TBST洗 3次10 min后分别放入生物素标记的羊抗兔FITC抗体（1∶2 000）和羊抗鼠 TRITC 抗体（1∶2 000）摇床1 h；TBST洗涤后，滴加ECL显色剂（化学发光底物和稳定剂以1∶1混合），应用DU-650型蛋白分析仪检测条带平均光密度值。运用Image Lab软件计算每组的蛋白含量。

2.5 统计学方法 数据采用SPSS 24.0软件进行分析。计量资料符合正态分布以（）表示，各组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较，方差齐则采用LSD－t检验，方差不齐则采用Games-Howell法。

3 结 果

与正常组比较，模型组大鼠纹状体的Akt、PAkt蛋白表达减少（P＜0.05）。与模型组比较，高剂量组 mTOR、Akt蛋白表达增加（P＜0.05），中剂量组 PAkt蛋白表达增加（P＜0.05）。 见图 1、表 1。

图1 4组大鼠纹状体中Akt、P-Akt、mTOR蛋白表达比较

表 1 4组大鼠纹状体 Akt、P-Akt、mTOR 蛋白的表达变化（）

表 1 4组大鼠纹状体 Akt、P-Akt、mTOR 蛋白的表达变化（）

注：与正常组比较，1） P＜0.05，2） P＜0.01；与模型组比较，3） P＜0.05，4） P＜0.01。

mTOR 0.70±0.18 0.56±0.12 0.60±0.15 0.40±0.151）0.63±0.08 0.88±0.293）组别正常组溶剂组模型组低剂量组中剂量组高剂量组n 8 8 8 8 8 8 Akt 0.94±0.624）0.82±0.19 0.53±0.072）0.72±0.51 0.51±0.233）0.62±0.104）p-Akt 0.87±0.073）0.67±0.034）0.36±0.031）0.26±0.021）0.50±0.011）3）0.49±0.101）

4 讨 论

PD是一种由于中脑黑质病变致多巴胺能神经元衰老死亡而出现以静止性震颤为主要表现伴有面部表情呆滞、行走缓慢、步态异常等临床症状的神经系统变性疾病［3］。祖国医学把帕金森病归属于“颤证”“不寐”“肝肾阴虚”等的范畴［4］。 《奇证论卷七》曰：“颤振一证，古云木火上盛，肾阴不充，……虚则肾亏，法宜清上补下”，故应补肾益精填髓，益气养血。陆征宇等［5］采用补肾填精方改善了PD患者的运动症状、认知功能障碍等。蔡晶教授经过长期临床实践，根据帕金森病的病机特点，创立了滋肾填精、补益肝肾、活血化瘀的苁蓉舒痉方［6］，方中君药肉苁蓉具有拮抗免疫衰老［7］、减轻细胞凋亡［8］、促进神经干细胞的增殖等的作用，在临床上配合美多巴等药物可改善PD有关症状。

在Akt／mTOR通路中，Akt被上游分子激活后，活化的Akt进一步导致下游mTOR的磷酸化［9］，进而影响和调控细胞的凋亡和自噬等［10］。在Akt／mTOR通路中，Akt具有抗细胞凋亡、促进细胞存活等的作用。mTOR是Akt／mTOR的下游分子,在保护神经元方面具有重要意义。

本实验结果显示：与正常组比较，模型组大鼠纹状体的Akt、P-Akt显著降低；苁蓉舒痉方干预14 d后，与模型组比较，中剂量组大鼠纹状体的P-Akt蛋白表达增高，高剂量组大鼠纹状体的Akt、mTOR蛋白表达显著增高。提示苁蓉舒痉方可以增加大鼠纹状体的Akt、P-Akt、mTOR的蛋白含量，促进 Akt的活化，从而激活Akt／mTOR通路，起到保护神经元的作用。

但本研究仅检测 Akt、P-Akt、mTOR 3个蛋白，未能全面检测Akt／mTOR通路的全部蛋白，也未能进一步做促进和抑制实验，故未能说明中医药治疗PD的更深层次机制，有待进一步研究。