牛运输应激综合征发生情况及防控对策

吴位珩，杨莉，姜玲玲，孙启跃，张涛，徐景峨，刘镜，杨茂生，余波，黄波，唐远江

（贵州省农业科学院畜牧兽医研究所，贵阳 550005）

牛运输应激综合征是长途贩运过程中多种应激原，如热、冷、风、雨、饥、渴、挤压、惊吓、颠簸、合群、调料、体力耗费、环境改变、潜在疾病等，导致机体抵抗力下降，病原微生物(如支原体、巴氏杆菌、大肠杆菌等）趁虚而入，引起呼吸道、消化道，乃至全身病理性反应的综合征候群[1]。近年来，随着贵州省攻坚扶贫的推进，各级政府坚持把产业扶贫作为精准脱贫的重要抓手，把畜牧业作为推进精准扶贫、精准脱贫的重要产业来抓，养殖产业呈现出持续、快速、健康发展的良好态势。在此形势下，肉牛引进量不断增大，但也带来了一系列流行病感染问题，其中肉牛运输综合征最为突出，给贵州省养牛生产造成了很大的损失。对此，项目组于2018年3～6月，对贵州省黔西县引进的能繁安格斯母牛进行了肉牛运输综合征发生情况调查，发现造成肉牛运输综合征的主要病因是牛支原体感染，且易继发和混合其他病原感染（如巴氏杆菌、寄生虫病等），严重的可造成死亡。根据牛支原体OPPD／F基因序列保守区间设计引物，建立了牛支原体PCR诊断方法，结合流行病学调查、临床症状及病原菌分离鉴定，对发生的疾病进行确诊，初步摸清贵州省肉牛运输综合征发生情况，并制定出肉牛运输综合征预防和治疗措施，取得了较好效果。现将具体情况介绍如下。

1 发病情况

2018年3月以来，恒大集团在贵州黔西县开展了产业扶贫的重点项目——发展安格斯牛养殖产业，从澳大利亚引进安格斯能繁母牛6 900头。由于缺乏引进大批国外牛群的经验，牛到场2～3d，出现运输应激综合征，其中死亡6头，130多头牛症状较严重，其余症状较轻，仅出现咳嗽、流黏性鼻液、结膜炎等现象。对此，贵州省畜牧兽医研究所科研人员进行了调研、取样、实验室分离诊断和药物敏感试验，并制定出防治对策，指导牛场采取了有效的防治措施，取得较好的效果，牛群健康恢复稳定。

2 发病牛临床症状表现

病牛体温升高、精神沉郁、食欲减退、被毛粗乱，出现咳嗽、气喘、流黏性或脓性鼻液、拉稀、血便、关节炎、结膜炎等症状，重症病牛极度消瘦，最后衰竭死亡。解剖死亡牛只，肺部有干酪样坏死灶或化脓性坏死灶，胸腔内有大量纤维性渗出液或脓性液体，部分出现肺与胸腔粘连、消化道溃疡等病症。

3 实验室诊断

3.1 样本的采集

无菌采集病死牛样本心、肺、肝、脾、肾、淋巴结等和发病牛鼻黏液样本，即鼻拭子，放置于有冰袋的采样箱中运输至实验室，进行分离培养、PCR检测等。

3.2 实验室分离培养

3.2.1 支原体的分离培养

将牛肺样本置于平皿中，无菌水冲洗3次，取中间部分，研磨，备用；鼻拭子用1mL生理盐水浸润，弃去药棉棒。将处理好的牛肺和鼻拭子用0.45μm滤膜过滤后接种于PPLO肉汤培养基中，5%CO2、37℃恒温培养48h，培养基由红变黄时转接于PPLO固体培养基中，经5%CO2、37℃恒温培养72h后，可见针尖大小、边缘整齐、“油煎蛋状”菌落[2,3]。

3.2.2 巴氏杆菌的分离培养

将病料组织（心、肝、脾、肾、淋巴结等），接种于10%犊牛血清肉汤培养基中，37℃恒温培养24h，此时肉汤均匀混浊，然后将培养物转接于10%犊牛血清固体培养基中，37℃恒温培养24h，可见灰白色、露珠状、针尖大小的菌落，美蓝染色镜检可见典型的两极着色、革兰氏染色为阴性的小杆状细菌[4]。

3.3 支原体PCR诊断

3.3.1 参考菌株

牛支原体菌株由华中农业大学动物医学院惠赠；嗜血杆菌、魏氏梭菌、大肠杆菌、多杀性巴氏杆菌、沙门氏菌、结核分枝杆菌均由贵州省畜牧兽医研究所畜禽疫病研究室提供。

3.3.2 引物

根据牛支原体OPPD／F基因序列，应用Primer Primer5.0基因分析软件进行引物设计，引物由宝生物工程（大连）有限公司合成，序列如下：

上引物：5’-ACGTGACTACTTCACCCTGAT- 3’，下引物：5’-TAGACCGACTATTTCACCTTC- 3’。

3.3.3 样本DNA的提取

（1）组织样本DNA的提取：取牛肺少许，剪碎，加入900μL生理盐水，反复冻融3次，5 000r/min离心5min，取上清液，加20μL蛋白酶K，100μL10%SDS液，55℃水浴至完全消化，冷却，备用。取1mL鼻拭子处理液，10 000r/min离心2min，收集沉淀。将处理好的样品液按核酸提取Mini试剂盒说明书操作提取模板，-20℃备用。

（2）分离培养菌株DNA的提取：取1.5mL菌液，10 000r/min离心2min，弃上清，收集沉淀。按核酸提取Mini试剂盒说明书操作提取模板，-20℃备用。

3.3.4 牛支原体特异性片段的PCR扩增

PCR反应扩增体系及反应条件分别见表1、表2。反应结束后将扩增产物取5μL进行2%琼脂糖凝胶电泳检测。结果见图1。

表1 PCR扩增反应体系

表2 PCR扩增反应条件

3.3.5 PCR法扩增的敏感性测定

采用TU-1800spc紫外可见光光度计，取OD值为260nm，将牛支原体DNA模板稀释100倍，测量浓度。根据模板浓度（μg/μL）=A260×稀释倍数×50/1000进行计算。测得牛支原体标准模板的OD260值为0.633nm，计算得出，提取的牛支原体标准DNA含量为0.5μg/μL。进行敏感性试验时，按10稀释法对DNA模板进行稀释，取2μL模板进行扩增，则牛支原体标准DNA浓度依次为1μg/μL、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7μg/μL。在PCR反应中，可检出的牛支原体标准DNA模板的含量最小是10-7μg/μL，即灵敏度为10-7μg/μL（图2）。

图1 牛支原体 PCR反应结果

图2 牛支原体PCR敏感性试验结果

3.3.6 PCR法扩增的特异性测定

分别用标准牛支原体菌株、嗜血杆菌、魏氏梭菌、大肠杆菌、多杀性巴氏杆菌、沙门氏菌、牛结核分枝杆菌DNA为模板，进行PCR扩增。除牛支原体出现扩增带，其他的菌株未见特异性226bp片段扩增（图3）。

图3 牛支原体PCR特异性试验结果

3.3.7 临床样品的检测

2018年3～6月，笔者所在团队采集黔西县金碧牛场、观音洞牛场、大关牛场、七里牛场牛肺样本和鼻拭子共163份，检出阳性样本60份，且与细菌学检验结果一致，同时将PCR扩增片段经胶回收，送大连宝生物工程有限公司测序，结果表明，扩增片段为牛支原体的特异性条带（图4）。

图4 临床样本的检测结果

3.4 牛巴氏杆菌PCR诊断

采用建立的多杀性巴氏杆菌(P m) P C R诊断方法，对1 0%犊牛血清培养基上的培养物进行P C R扩增，结果可见在2 7 5 b p出现目标带，判断为阳性（图5）。引物的序列为：P m 1 5'-TGATTAGTGAGCCGAGTAAG-3'；Pm2 5'-TGGTGCGTTATTGTTGTTG-3'。

图5 牛巴氏杆菌PCR反应结果

3.5 牛疥癣病的诊断

根据养殖场的发病情况、结合临床症状可以对病情进行初步诊断。实验室诊断如下：在患病牛患病部位和健康部位交界处，用经过消毒的凸刃小刀沿着牛体表垂直方向刮取牛皮屑组织，直到皮肤组织轻微出血为止，将皮屑组织放入到试管中，向其中加入10%氢氧化钠溶液充分加热，等到皮屑溶解之后，取沉淀物制成涂片，用100倍显微镜观察，此时可发现成虫和黄白色虫卵。成虫身体呈圆形，似龟状，微黄白色，背面隆起，腹面扁平。将收集到的皮屑组织放在白纸上，加热皮屑，随着温度的升高可以看到有成虫从皮屑组织爬出，长度在0.33～0.45mm，躯体分为背胸部和背腹部，躯体前方有1假头，躯体腹面有4对短而粗的足，由此可以确诊为牛疥癣病。

3.6 诊断结论

通过试验，结合临床症状，确诊为牛支原体肺炎，严重的继发牛出败（牛巴氏杆菌病），造成死亡。另外，由于引进牛部分患有疥癣，运输综合征的发生加剧了疥癣的感染。

4 药物敏感试验

将分离的菌株进行药敏试纸抑菌试验。试验用药敏试纸有：呋喃妥因、头孢曲松、利福平、头孢西丁、呋喃唑酮、氨苄西林、强力霉素、青霉素G、林可霉素、头孢呋辛、阿莫西林、头孢噻肟、新霉素、头孢哌酮、四环素、链霉素、头孢唑啉、卡那霉素、氟苯尼考（购自杭州滨和微生物试剂有限公司，生产许可证：20100290号）。细菌药敏试验按产品说明书规定进行，支原体药敏试验的培养条件同支原体分离培养，根据抑菌圈直径大小判断药物敏感性，判断标准参照产品说明。药敏试验结果显示：不同牛场分离的牛支原体药敏特性有较大差异，菌株对新霉素、氟苯尼考敏感，部分菌株对链霉素、四环素、卡那霉素、强力霉素较敏感，对呋喃妥因、头孢曲松、利福平、头孢西丁、呋喃唑酮、氨苄西林、青霉素G、林可霉素、头孢呋辛、阿莫西林、头孢噻肟、头孢哌酮、头孢唑啉不敏感。

5 防治措施

5.1 治疗

肺部感染严重，并伴有高热及关节炎症状的，肌注新霉素或者氟苯尼考，5d为一疗程。若出现混合感染多种病原现象时，治疗时也可采用四环素、庆大霉素、地塞米松合并用药，采用葡萄糖和维生素C进行补液，5～7d为一个疗程。若伴有消化道症状，可肌注氟本尼考，肠炎出血的静注止血药，以葡萄糖和维生素C进行补液，5d为一疗程。出现结膜炎症状的采用青霉素稀释后喷雾治疗。伴有牛疥癣的，在采取治疗肺炎的同时使用伊维菌素治疗，用量为每千克体重0.2mg，皮下注射，间隔1周再用药1次；同时，采用1%敌百虫药液喷雾淋洗患病牛，用药前让牛饮足水，同时保定好牛，避免牛舔舐药液，间隔1周再用药1次。在采用抗生素治疗的同时，课题组还采用了自主研发的治疗呼吸道病的中药“大白芩散”，配方为大青叶42g、百部15g、黄芩43g，进行中西医结合治疗，每天一次，连用5d，取得了较好的治疗效果。

5.2 综合防治

5.2.1 严格引进新牛

不从疫区或发病区引进牛。做好布病、口蹄疫、支原体病、结核等疾病的检疫防疫工作，如果要在购买地注射相关疫苗，应隔离现察15～20d后方可装车。运输车辆要进行防滑处理，在车厢内铺干草或者是草垫等，以起到护蹄、防滑、防摔倒的作用。在运牛前要对运输车辆、装卸牛台、接收牛场(牛舍)、相关用具等进行全面消毒，可用消毒灵、新洁尔灭、火碱、生石灰等彻底消毒。运输牛的押车人员要选择有一定经验、了解牛习性的人员，以使牛在途中可以得到精心照料，出现紧急情况时还能进行必要的救治，从而降低牛的应激反应。运输前按购牛地的饲养习惯和饲料进行饲喂，不能饲喂多汁牧草等易造成腹泻的饲料，要减少精料喂量。要在装车前4h左右喂料及饮水，只喂八成饱，以防过饱在途中颠簸伤害肠胃。在运输过程中，要备足草料，按每头牛5kg/d计算出草料总量。运输途中汽车的起步或停车要缓慢、平稳，中途要匀速行驶，高速路按80～100km/h行驶，其他道路或弯道的地方应控制在40～60km/h。长途运输过程中，每行驶2～4h要停车检查1次，每隔6～8h给牛饮水1次，每天饲喂优质青干草5kg，尽最大努力减少运输引起的应激反应。

5.2.2 加强饲养管理

牛场保证良好的卫生环境非常重要，牛舍要保持干燥、清洁、通风良好，注意防寒保暖，要定期对肉牛场的设施设备进行清洁、消毒，控制饲养密度，防止过于拥挤。饲喂品质优良的饲料，补充适量的精料、微量元素和维生素，确保日粮含有全面、均衡的营养，增强机体抵抗力。

5.2.3 加强疾病预防

定期消毒牛舍，及时发现和隔离病牛，做到“早诊断，早治疗”，同时研制并开发兽用中药来防控该病的发生和流行，以确保牛运输迁徒的安全[5～8]。