中国荷斯坦牛HH4遗传缺陷单倍型分子筛查

李艳华，吕小青，刘林，麻柱

（北京奶牛中心/农业农村部奶牛遗传育种与繁殖重点实验室/奶牛遗传育种与繁殖北京市重点实验室，北京 100192）

在奶牛育种中，由于基因组选择等现代分子育种技术的应用，在极大地提高选择准确性的同时，也提高了选择强度。由于人工授精（AI）等繁殖生物技术的应用，使部分优秀种公牛得到广泛使用，增加了群体的近交系数，降低了群体有效含量，隐性基因纯合的概率加大，使缺陷基因在奶牛群体中不断涌现。随着基因组学研究的不断深入和高通量测序技术的迅猛发展，对奶牛隐性遗传缺陷的挖据、鉴定与剔除速度不断加快。

近年来，在荷斯坦牛群中不断发现了许多有害单倍型或致死突变，其中大多数影响奶牛繁殖效率或增加胚胎死亡率，是新近在牛群中出现的隐性遗传缺陷的新形式。当这些有害单倍型隐性纯合时，就会表现出不同类型的临床症状，如胚胎早期死亡等，是奶牛群繁殖健康的隐性杀手，严重影响着奶牛养殖者的经济效益[1～3]。

Fritz等[2]利用法国基因组选择数据库中47 878头荷斯坦牛、16 833头蒙贝利亚牛和11 466头诺曼底牛的Illumina 50k 芯片分型数据，鉴定到34个在成活的个体中有明显缺陷的纯合子常见单倍型（频率大于1%），每种单倍型均可能携带有害突变。数据分析表明，34个单倍型中有9个对繁殖性状有显著影响，其中包括6个新鉴定的单倍型：HH4、HH5、HH6、MH1、MH2和NH5。按照这种单倍型的命名惯例，第一个字母表示品种，第二个字母H表示单倍型，然后是顺序号。VanRaden等[4]于2011年首次报道了3种单倍型：HH1、HH2和HH3，Fritz等[2]又命名了14个新荷斯坦牛单倍型HH4～HH17。

单倍型4（Holstein Haplotype 4，HH4）的致病机理是1号染色体上的GART（Glycinamide Ribonucleotide Transformylase，甘氨酰核糖核苷酸转化酶）基因g.1277227A＞C突变，导致编码区的天冬酰胺突变为苏氨酸（p.N290T），突变后致使GART基因功能丧失，阻碍了生物体中的嘌呤合成，最终导致胚胎在妊娠早期死亡[2]。本研究旨在对HH4单倍型在我国荷斯坦牛群中携带情况进行摸底筛查，以掌握HH4单倍型在奶牛群中分布情况，为奶牛群的选种选配提供依据，为今后我国奶牛育种工作提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

试验材料来自北京地区332头种公牛冻精样品及分布在24个奶牛场的1 151头荷斯坦母牛血液样品，采用高盐法从牛冻精中提取基因组DNA[5]，采用试剂盒从血液中提取基因组DNA，然后使用微量核酸测定仪检测DNA质量，要求光密度比值OD260/OD280在1.8～2.1之间、OD260/OD230大于2.0、浓度均在100ng/μL以上为合格。

1.2 基因分型检测

本研究选取MALDI-TOF-MS（基质辅助激光解析串联飞行时间质谱）检测技术对HH4单倍型进行基因分型。

1.2.1 引物设计及PCR扩增

根据GenBank上牛AC_000158.1 (1265743..1292033)序列，利用AssayDesigner 3.1软件设计特异性PCR引物。F/R:ACGTTGGATGTGAAGGTGTCCTCTATGCTG/ACGTTGGATGTTACTCACTTGGCACTCTGG；单碱基延伸引物：TCACCGAAACGGCAA。扩增引物的终浓度为100μM，延伸引物的终浓度为500μM。

PCR反应体系为：ddH2O1.8μL，10×PCR Buffer 0.5μL，MgCl2（25mM）0.4μL，dNTP Mix（25mM）0.1μL，Primer Mix（0.5μM）1μL，HotStar Taq（5U/μL）0.2μL，混合试剂按每孔4μL加到384个孔板中，模板加入体积为1μL，保证总的反应体积为5μL。

扩增PCR反应程序为：94℃ 15min；94℃ 20s，56℃ 30s，72℃ 1min，45个循环；72℃ 3min；4℃保存。PCR反应完成后进行电泳，吸取2μL上样缓冲液，1μL PCR产物，设定电压为110V，电流为75mA，40min后观察结果，如结果良好可继续SAP反应。

1.2.2 SAP反应

在PCR产物中加入2μL碱性磷酸化酶（SAP，Sequenom）消化液：ddH2O1.53μL、缓冲液0.17μL、SAP 0.474U，以除去未用尽的dNTP，保证下一步单碱基延伸的正确性。此反应程序为：37℃40min，85℃ 5min，4℃保存。

1.2.3 单碱基延伸反应及检测

单碱基延伸反应体系：ddH2O 0.619μL，iPLEX Buffer Plus 0.20μL，iPLEX Termination mix 0.20μL，iPLEX Extend Primer Mix 0.94μL，iPLEX Enzyme 0.041μL。反应条件：94℃ 30s；94℃ 5s，52℃ 5s，40个循环；80℃ 5s，5个循环；72℃ 3min；4℃保存。在终止反应物中加入阳离子交换树脂脱盐导入Assay中，样本输入、建板、点样，然后进行Mass Assay分析，质控并收集最终数据。

2 结果

利用飞行时间质谱技术对北京地区332头荷斯坦公牛和1 051头荷斯坦母牛进行了HH4单倍型分型检测，结果显示，所有样本均为AA基因型正常个体，未检测到携带者个体。分型散点图如图1所示。

图1 GART基因分型散点图

由图1可见，通过Sequenom MassArray平台对GART基因进行分型检测，在群体中仅检测到一种基因型——AA型，在90°密集分布，且无检测个体偏离正常的分布区域外，说明检测结果准确、可靠。

3 讨论

HH4是新近在荷斯坦牛群中发现的一种隐性致死单倍型，当HH4单倍型隐性纯合时，可导致奶牛胚胎早期致死，影响奶牛繁殖效率。2013年，Fritz等[2]报道了HH4遗传缺陷单倍型在法国荷斯坦牛群体中的频率为3.6%。如果携带者公牛与疑似携带者母牛交配，那么青年母牛妊娠率降低5.80%，经产母牛妊娠率降低1.74%，严重影响奶牛繁殖性能，可给奶牛养殖者带来巨大经济损失。而HH4单倍型在美国牛群中基因频率较低，仅为0.37%[6]，说明该遗传缺陷单倍型在不同国家分布差异较大，其影响也是不同的。

本研究对北京地区332头荷斯坦种公牛和1 151头荷斯坦母牛进行了HH4筛查，未检测到HH4携带者个体，说明北京地区的荷斯坦牛群基本不受HH4单倍型影响或影响很小，在奶牛场选种选配的时候可以不予考虑。劳兰兰等[7]研究表明，通过对国内466头荷斯坦种公牛进行筛查，发现6头携带者，均可以追溯到共同祖先法国名牛Besne Buck（注册号：HOFRAM4486041658），提示我国荷斯坦牛群体中HH4缺陷单倍型是在遗传物质的引进过程中带入的。据该研究报道，国内种公牛HH4携带率仅为1.2%左右[7]，进一步印证了该缺陷单倍型在我国荷斯坦牛群中频率较低，这可能是由于我国近年来主要从北美及澳大利亚等国引进种牛遗传物质，而从欧洲引入遗传物质较少。

虽然HH4单倍型在我国荷斯坦牛群中携带率较低，对奶牛养殖影响不大，但其他新发现的单倍体如HH1、HH3、HH5～HH7等在我国牛群中的携带情况尚不清楚，建议继续开展相关研究，以摸清这些新遗传缺陷单倍型在我国荷斯坦牛群中的分布情况，进一步指导奶牛群的选种选配及改良计划。

4 结论

本研究利用飞行时间质谱技术对北京地区全部荷斯坦公牛（332头）及部分良种母牛（1151头）的HH4单倍型携带情况进行了筛查，结果表明，在所检测的奶牛群体中，未检测到HH4缺陷单倍型存在，其携带率为0。结果表明，北京地区的荷斯坦牛群不受HH4单倍型影响或影响很小，在进行选种、选配的时候可以不予考虑。但是在进口种牛遗传物质时，应关注HH4携带情况，避免将该缺陷单倍型引入到我国荷斯坦牛群中，给我国奶牛养殖带来潜在危害。