湖南部分地区奶牛乳房炎主要病原菌的分离鉴定及药敏试验

王慧，刘伯承，段洪峰，何芳，杜丽飞，周望平，彭苗苗，杨俊

（湖南省畜牧兽医研究所，长沙 410131 )

奶牛乳房炎是制约奶业发展的常见疾病，其发病率高、防治困难、治疗费用昂贵的特点给奶牛行业造成了巨大的经济损失。奶牛乳房炎病因复杂，多由多种病原菌引起。细菌性乳房炎可使奶牛泌乳机能受损，减少泌乳量，引起生鲜乳质量不达标，导致生殖机能失调，影响发情率，奶牛生产性能降低，造成严重的经济损失，而且间接危害人类健康[1]。调查研究显示，大约80%的临床型乳房炎患牛乳汁中能够检出细菌，细菌种类多达20余种，以金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和链球菌为主，占奶牛乳房炎病例的80%以上[2,3]。目前治疗奶牛乳房炎的药物主要以抗生素为主，虽然抗生素在临床上发挥了巨大的作用，但是由于使用不规范以及过度使用，往往导致药物残留，甚至可能导致耐药菌株出现，治疗效果降低，同时影响乳制品质量和造成环境污染。为了避免以上问题，本试验采集了湖南部分地区乳房炎奶牛的奶样，进行主要病原微生物的分离鉴定，并通过药敏试验检测其耐药情况同时筛选出有效的治疗药物，从而为该地区制定奶牛乳房炎的治疗方案提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要仪器设备

PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统、显微镜、恒温培养箱、离心机、超净工作台、水浴锅、移液枪、接种环。

1.1.2 主要试剂

血琼脂平皿、营养肉汤、药敏纸片，购自长沙市宝生盾生物科技有限公司；16S RNA通用引物，由华大基因合成。

1.2 方法

1.2.1 乳样采集

于2018年6～7月，采集湖南某地区三个中等规模奶牛场临床型乳房炎患牛乳样74份。采样前，先清洗乳头，再对采样乳区进行消毒处理，弃去前3把奶，然后取乳样10mL，存放于4℃保温箱中，并尽快送至实验室检验。

1.2.2 奶牛乳房炎判断标准

牛乳体细胞数（SCC）推荐分级标准参照国际乳业联合会（IDF）的规定，其中SCC＜50万个/mL为健康奶牛；100万个/mL＞SCC＞50万个/mL为隐性乳房炎；SCC＞100万个/mL为临床型乳房炎[4]。

1.2.3 细菌分离纯化培养

用灭菌棉签蘸取少许奶样涂抹于血琼脂平皿上，待奶样完全吸收后倒置于37℃培养箱中，培养12～18h，选取典型的优势菌落划线接种于新的血琼脂平皿上，继续培养12～18h。挑取单个菌落进行革兰氏染色，初步鉴定细菌特征。

1.2.4 病原菌的PCR测序鉴定

对所有细菌均用 1 6 S R N A(2 7 F/1 4 9 2 R)通用引物进行扩增，序列为：2 7 F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'；1492R：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'，扩增片段长度为1 500bp左右，然后通过测序鉴定细菌的类别。挑取纯培养后的细菌于灭菌纯水中混合，于100℃水浴10min，再置于冰块上10min以上，然后离心取上清液作为病原菌基因组的PCR模板，再进行基因片段的扩增，并用琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果，再进行基因测序，然后进行Blast比对，确定病原菌类别。最后采用普通肉汤进行增菌培养，用50%甘油于-80℃保存备用。

1.2.5 细菌耐药性试验

采用K-B纸片扩散法，对分离出的主要病原菌进行药敏试验，按照CLSI推荐的肉汤稀释法及标准[5]判断其耐药性。选用的药物有氨苄西林、四环素、青霉素、链霉素、丁胺卡那、头孢拉啶、恩诺沙星、磺胺异噁唑。

2 结果与分析

2.1 主要病原菌分离株种类及比例

在采集的74份奶样中，有56份奶样分离到细菌，共88株细菌，采用病原菌的分离、纯化以及16S RNA通用引物扩增测序比对判断感染病原菌的类型。检出率为77.78%（56/72），其中：金黄色葡萄球菌40株，占总分离菌株数的45.45%；表皮葡萄球菌2株，占总分离菌株数的2.27%；大肠杆菌16株，占总分离菌株数的18.18%；乳房链球菌12株，占总分离菌株数的13.64%；棒状杆菌9株，占总分离菌株数的10.23%；其他细菌9株，占总分离菌株数的10.23%（表1）。由此可见，引起该地区奶牛乳房炎的主要致病优势菌为葡萄球菌、乳房链球菌和大肠杆菌。

表1 样品中主要病原菌分离株鉴定结果

2.2 病原菌的感染情况

经过试验统计分析，病原菌单独感染的情况占57.14%（32/56），其中：金黄色葡萄球菌单独感染的占35.72%，乳房链球菌单独感染的占8.93%，大肠杆菌单独感染的占7%。混合感染的占比为42.86%（表2），主要为金黄色葡萄球菌与其他病原菌的混合感染，棒状杆菌没有单独感染的情况。

表2 病原菌感染情况

表3 主要病原菌药敏试验结果

2.3 药物敏感性试验结果

对分离到的主要病原菌包括金黄色葡萄球菌、乳房链球菌、大肠杆菌进行药物敏感性试验。金黄色葡萄球菌随机选择了21株进行试验，乳房链球菌（12株）和大肠杆菌（16株）全部进行了试验。参照CLSI判定标准比较抑菌圈直径的大小，检测病原菌对各种药物的敏感程度。从表3可以看出，三种病原菌都有不同程度的耐药性，金黄色葡萄球菌和乳房链球菌的耐药性比较广泛，大肠杆菌耐药性相对较轻。其中三种病原菌对链霉素和磺胺异噁唑均有较高的耐药性，另外金黄色葡萄球菌和大肠杆菌对青霉素和氨苄西林也有较强的耐药性，乳房链球菌对四环素有较强的耐药性。只有头孢拉啶和恩诺沙星对三种病原菌均有较强的杀灭和抑制作用。因此治疗该地区奶牛乳房炎的首选药物为头孢拉啶和恩诺沙星，或第一代头孢或氟奎诺酮类药物。

3 讨论

从本试验的细菌分离结果可以看出，目前引起湖南部分地区奶牛乳房炎的主要病原菌是金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、乳房链球菌和棒状杆菌，占致病菌总数的89.77%，其中金黄色葡萄球菌的分离率最高。与国内其他地区的报道基本一致[6,7]，大多数奶牛乳房炎不止是由单一的某一种致病菌引起的，而是多种细菌共同感染所致，由表2的结果也可证实这一点。金黄色葡萄球菌主要损害乳房上皮细胞和腺泡的生理功能，导致牛奶产量和质量下降[8]；大肠杆菌和乳房链球菌是奶牛场的常在菌，牛舍中的粪便、牛食用的草料以及牛床垫料等都存在这些环境性病原菌，加上南方湿热的气候更有利于环境中病原菌的滋生，从而导致大肠杆菌和乳房链球菌的易感性；棒状杆菌可引起动物化脓性感染，可继发奶牛乳房炎并使病情加重，加大治疗难度。因此加强牛舍的环境消毒及挤奶过程的消毒，做好生物安全措施等对降低奶牛乳房炎的感染率具有重要作用，同时做好奶牛乳房保健、合理免疫、科学饲养等对于防控奶牛乳房炎也具有重大意义。

通过药物敏感性试验，表明奶牛乳房炎病原菌对临床上常用的各种抗菌药物均产生了不同程度的耐药性，在本次试验中耐药性最严重的是链霉素和磺胺异噁唑，其次是青霉素和氨苄西林、四环素，只有头孢拉啶和恩诺沙星的敏感性较强。这可能与奶牛场平时的治疗习惯密切相关，过度使用或滥用抗生素以及用药程序不规范等造成奶牛场常在菌耐药的产生，由此导致治疗效果不明显，甚至大量的耐药细菌感染或定植于牛乳中，可使耐药细菌的传播和耐药基因从动物向人类转移的风险更高。细菌对抗生素耐药性的传播和多重耐药病原菌的发展已被世界卫生组织认为是困扰人类细菌感染医学治疗的一个严重问题[9]。因此，对生鲜牛乳中主要病原微生物的分离鉴定以及常在致病菌耐药性的检测，可为解决兽药残留问题、地区常在致病菌耐药问题和兽药监管体系建设与完善提供专业指导依据，为牧场或奶牛场的饲养管理提供更合理有效的用药方案。

目前细菌耐药性已经引起全球广泛关注与重视，欧美等奶业发达国家已颁布多项抗生素使用相关法律法规，并加强抗生素替代药物的研发投入，同时建议建立测量细菌抗生素耐药的实验室标准，要求农场主必须签订抗生素使用责任状[9～11]。我国为了加强兽用抗生素等药物管理，确保动物源性食品安全及公众健康，原农业部兽医局在2017年组织起草了《全国遏制动物源细菌耐药行动计划（2017年-2020年）》，2018年国家又制定了《兽用抗菌药使用减量化行动试点工作方案》，力争通过实施养殖环节兽用抗菌药使用减量化行动试点工作，推广兽用抗菌药使用减量化模式等，实现兽用抗菌药使用量“零增长”，同时兽药残留和动物细菌耐药问题也得到有效控制。今后，如何在减少抗生素使用的同时能保障奶牛乳房炎得到有效治疗，具有中国特色的中草药、微生态等制剂或是中西医结合治疗，或将成为研究的重点。