持续热应激对荷斯坦牛和西荷杂交牛生理指标和机体代谢的影响

2019-09-12王泽栋张林李烨青曾涵芳朱靖妥生海韩兆玉

中国奶牛 2019年8期

王泽栋，张林，李烨青，曾涵芳，朱靖，妥生海，韩兆玉

（南京农业大学动物科技学院，南京 210095）

荷斯坦牛具有产奶量高、耐寒却不耐热的特点，高温高湿的环境极易引起其热应激反应，造成健康状况差、繁殖力低和高淘汰率等问题[1～5]，给养殖业带来经济损失。我国南方地区为亚热带季风气候，夏季高温高湿，极端气温高达39.7℃，年平均降水量高达1 106mm，极易造成奶牛热应激。为了减少奶牛热应激的发生，奶牛养殖业已在营养调控[6]、饲养管理等方面[7～9]投入了大量精力，但成效有限。近年来，研究发现，高产奶牛的长期品种内选育是造成奶牛热敏感性上升、耐热性能下降的重要原因之一，因此，通过多品种杂交选育兼顾产奶量和耐热性的奶牛新品系可能是解决这一问题的重要途径。经调查发现，西门塔尔牛具有耐热、耐粗饲、乳脂高、使用年限长、繁殖力强等特点，属乳肉兼用型牛。据报道，荷斯坦牛与西门塔尔牛的杂交后代表现出很好的遗传互补和杂种优势，特别是耐热性、繁殖性能和乳品质方面表现突出[10～12]。因此，本研究以荷斯坦牛和西荷杂交牛为研究对象，通过检测试验牛生理生化、抗氧化指标和HSP70的变化，探索不同奶牛品种对长期热应激的生理响应，以期为缓解南方地区奶牛热应激和选育耐热性能优良的奶牛品种提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验设计

本试验在南京卫岗乳业西岗奶牛场进行，选择18月龄健康的中国荷斯坦牛和西荷杂交牛各8头作为研究对象。其中，西荷杂交牛为西门塔尔牛（父本）和荷斯坦牛（母本）的杂交一代牛。饲养试验从4月初持续到8月底，跨越非热应激至热应激后期，从中选4个阶段采样测定各项指标，分别为：非热应激期（4月1～3日）、热应激初期（6月1～3日）、热应激中期（7月16～18日）和热应激后期（8月26～28日）。试验期间牛群统一舍饲散养，自由采食和饮水，日粮营养水平参照南京卫岗乳业西岗牧场饲养标准。

1.2 测定指标

1.2.1 牛舍温湿指数（THI）

试验期间分别测定牛舍的温度和湿度，每个阶段连续测定3d。在牛舍中部和四周距地面高1.5m的地方分别悬挂温湿度表，每天8:00、14:00和20:00分别读取牛舍的温度（T，℃）和相对湿度（RH，%），并利用公式[13]计算THI，THI＝（1.8×T+ 32）-（0.55-0.55×RH）×（1.8×T-26）。

1.2.2 直肠温度和呼吸频率

在试验期每阶段的第3天，分别用兽用体温计和秒表测定两组牛的直肠温度和呼吸频率。

1.2.3 血清指标

在试验期每阶段的第3天，对两组牛进行尾静脉采血（10mL）。血液样品静置1h后，经3 000r/min离心15min，收集血清并置于-20℃下保存待测。

采用全自动生化分析仪和酶标仪测定血清指标。检测指标包括总蛋白（TP）、白蛋白（ALB）、球蛋白（GLB）、葡萄糖（GLU）、乳酸脱氢酶（LDH）、肌酸激酶（CK）、谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、碱性磷酸酶（ALP）、Na+、Cl-、K+、Ca2+、总抗氧化能力（T-AOC）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、皮质醇（COR）和热休克蛋白-70（HSP70）。试剂盒均购自南京建成生物工程所。

1.3 数据分析

试验数据经Excel 2010初步整理后，用SPSS 20.0的GLM程序进行统计分析，多重比较采用Duncan法。结果均用平均值±标准误表示。

2 结果

2.1 试验牛舍环境温湿指数

研究[13]认为，当牛舍环境THI低于72时，奶牛不会出现热应激；当THI在72～78之间时，奶牛会出现轻微热应激；当THI在78～88之间时，奶牛会出现中度热应激；当THI在89～98之间时，奶牛会出现极严重热应激；当THI大于98时，奶牛将会死亡。由表1可知，在非热应激期，牛舍的日平均温度为17.33℃，相对湿度为49.67%，THI值为61.74，此环境下试验牛不会产生热应激。在热应激前期，牛舍的日平均温度为28.78℃，相对湿度为46.44%，THI值为76.19，此环境下奶牛会出现轻微热应激；热应激中期时，牛舍的日平均温度达到32℃，相对湿度为47.11%，THI值为80.41，此环境下奶牛会出现中度热应激；热应激后期时，牛舍的日平均温度为27.78℃，相对湿度为52.78%，THI值为75.71，此环境下奶牛会出现轻微热应激。

表1 牛舍环境的温湿指数

2.2 热应激对试验牛生理指标的影响

表2 热应激对试验牛直肠温度和呼吸频率的影响

由表2可知，和非热应激期相比，当出现热应激时，荷斯坦牛的直肠温度和呼吸频率均显著升高（P＞0.05）；西荷杂交牛的呼吸频率显著升高（P＞0.05），而直肠温度变化不显著（P＞0.05）。此外，在整个热应激期，西荷杂交牛的呼吸频率均显著低于荷斯坦牛（P＞0.05）。结果表明，持续热应激环境会引起荷斯坦牛和西荷杂交牛的直肠温度和呼吸频率的动态变化；而西荷杂交牛能够更好地维持直肠温度和呼吸频率的稳定。

2.3 热应激对试验牛血清生化指标的影响

表3 热应激对试验牛血清生化指标的影响

由表3可知，和非热应激期相比，整个热应激期内荷斯坦牛和西荷杂交牛的TP、GLB、ALT和AST的含量均逐渐降低（P＜0.05）。其中，ALB的含量先降低，升高到非热应激期水平后又显著降低（P＜0.05）；GLU的含量逐渐降低，热应激后期时又升高到热应激前期水平，但整个热应激期均低于非热应激期（P＜0.05）。整个热应激期荷斯坦牛和西荷杂交牛的LDH含量均显著增加（P＜0.05），其中热应激前期西荷杂交牛的LDH显著低于荷斯坦牛（P＜0.05）。同时，整个热应激期CK无显著变化（P＜0.05），但均低于非热应激期（P＜0.05）。和非热应激期相比，整个热应激期荷斯坦牛和西荷杂交牛的ALP含量均降低（P＜0.05），其中荷斯坦牛的ALP含量先降低后升高，而西荷杂交牛的ALP含量逐渐降低。此外，结果还显示，热应激中期和后期西荷杂交牛的GLB和AST显著低于荷斯坦牛（P＜0.05）；热应激前期和后期西荷杂交牛的ALT显著高于荷斯坦牛（P＜0.05）；热应激中期西荷杂交牛的ALP显著高于荷斯坦牛（P＜0.05），而到热应激后期时则显著低于荷斯坦牛（P＜0.05）。结果表明，持续热应激环境会引起荷斯坦牛和西荷杂交牛血清生化指标的动态变化，其中GLB、ALT、AST和ALP两品种间有显著差异。

2.4 热应激对试验牛血清离子水平的影响

由表4可知，和非热应激期相比，热应激中期和后期荷斯坦牛和西荷杂交牛血清Na+含量均显著升高（P＜0.05）。在整个热应激期，荷斯坦牛和西荷杂交牛的Cl-逐渐升高，而Ca2+含量先升高后降低，但和非热应激期相比均无显著差异（P＜0.05）。和非热应激期相比，热应激期荷斯坦牛血清K+含量随时间推移先降低后升高（P＜0.05），而西荷杂交牛无显著变化（P＜0.05）。结果表明，持续热应激环境会引起荷斯坦牛和西荷杂交牛血清离子的动态变化，但两组牛间无显著差异。

表4 热应激对试验牛血清离子的影响 (mmol/L)

2.5 热应激对试验牛血清抗氧化指标影响

由表5可知，和非热应激期相比，处于热应激期时荷斯坦牛和西荷杂交牛的T-AOC和SOD均先升高后降低（P＜0.05）；MDA先降低后升高（P＜0.05）。和非热应激期相比，热应激期荷斯坦牛的GSH-PX升高后降低（P＜0.05），而西荷杂交牛无显著差异（P＜0.05）。此外，结果还显示，热应激前期西荷杂交牛的T-AOC和SOD显著高于荷斯坦牛（P＜0.05）；热应激后期西荷杂交牛的GSH-PX和SOD显著高于荷斯坦牛（P＜0.05），而西荷杂交牛的MDA显著低于荷斯坦牛（P＜0.05）。结果表明，持续热应激环境会引起荷斯坦牛和西荷杂交牛血清抗氧化指标的动态变化，而西荷杂交牛的抗氧化能力优于荷斯坦牛。

表5 热应激对试验牛血清抗氧化指标的影响

2.6 热应激对试验牛血清内分泌激素和HSP70的影响

图1 热应激对试验牛血清COR和HSP70的影响

由图1可知，和非热应激期相比，热应激期荷斯坦牛和西荷杂交牛的COR均显著降低（P＜0.05），且先降低后升高；其中热应激前期两组牛的COR显著低于热应激后期（P＜0.05）。和非热应激期相比，热应激前期和中期时荷斯坦牛和西荷杂交牛的HSP70含量均显著升高（P＜0.05），在热应激后期又降低至非热应激水平。此外，结果显示，非热应激期、热应激前期和中期时西荷杂交牛的COR显著高于荷斯坦牛（P＜0.05）；热应激前期、中期和后期西荷杂交牛的HSP70均显著高于荷斯坦牛（P＜0.05）。结果表明，持续热应激环境会引起荷斯坦牛和西荷杂交牛血清中COR和HSP70的动态变化，而西荷杂交牛在长期热应激状态下具有较好的耐热性能。

3 讨论

3.1 持续热应激对试验牛生理指标的影响

家畜通过自身机制的调节可使其直肠温度在一定的范围内上下波动。当奶牛处于热应激状态时，直肠温度会逐渐升高，奶牛的行为和生理生化指标也将会发生相应的变化。本研究结果表明，热应激中期荷斯坦牛的直肠温度显著高于非热应激期（P＜0.05）；在整个试验期西荷杂交牛直肠温度均无显著变化。牛在正常情况下的呼吸频率为20次/min，廖晓霞等[14]指出，当奶牛处于轻度热应激时，呼吸频率为50～60次/min；中度等热应激时呼吸频率为80～120次/min；严重热应激时，呼吸频率可达120～160次/min。这与本试验结果基本一致，本研究发现，与非热应激期相比，热应激早期荷斯坦牛呼吸频率升高了57.26%，西荷杂交牛升高了40.17%；热应激中期荷斯坦牛呼吸频率升高了99.97%，西荷杂交牛升高了92.96%；热应激后期荷斯坦牛呼吸频率升高了47.25%，西荷杂交牛升高了41.09%。另一方面，本研究结果表明，西荷杂交牛的呼吸频率显著低于对应时期的荷斯坦牛（P＜0.05），且增长幅度小。有报道称呼吸频率过快必然导致奶牛心脏负荷增加，导致血液中CO2分压下降，从而诱使机体发生呼吸性碱中毒[15]。由此表明，西荷杂交牛较适宜在热应激环境下生存，其耐热性能优于荷斯坦牛。

3.2 持续热应激对试验牛血清生化指标的影响

ALP是一种反映成骨细胞活性、骨生成状况和钙磷代谢的重要指标[16]，ALP活性降低意味着 ATP的分解减少，伴随着血钙和血磷含量减少。Perana等[17]研究结果表明，在热应激环境下ALP降低，这与本研究结果一致。CK是与细胞内能量运转、肌肉收缩、ATP再生有直接关系的重要激酶[18]，非热应激和热应激时期西荷杂交牛的CK比荷斯坦牛高，但差异不显著。GLU作为重要的营养性单糖，是动物代谢活动快速供能最有效的营养素。Scharf等[19]报道，急性热应激时肉牛血清GLU含量会升高，而慢性热应激时则会降低。血清中TP、ALB含量直接反映了动物机体蛋白质代谢的代谢状况。蛋白质代谢良好时，血清中TP、ALB含量较低。本研究中,奶牛在夏季因气候变化所引起的热应激当属于慢性热应激, 在该热应激期的3个阶段, 试验牛血液中的GLU含量均呈现显著下降，TP含量显著下降，且西荷杂交牛TP含量下降程度更明显，这说明热应激对奶牛GLU代谢的影响更大，而西荷杂交牛蛋白质代谢优于荷斯坦牛。本研究还发现荷斯坦牛和西荷杂交牛热应激状态下血清LDH显著升高（P＜0.05），且西荷杂交牛在热应激前期LDH水平显著低于荷斯坦牛（P＜0.05）。原因可能是LDH参与了无氧酵解，LDH可能导致机体乳酸水平增加，引起酸中毒，而酸中毒会影响呼吸，使机体出现呼吸功能障碍，致机体缺氧。然而在此情况下，为保证中枢神经、心脏等重要器官的供氧，其他组织极可能在缺氧情况下采取无氧酵解方式供能。而无氧酵解运动增强时，又会使机体LDH升高，这说明西荷杂交牛抗酸中毒能力强于荷斯坦牛，抗热应激能力更强。

3.3 持续热应激对试验牛血清离子水平的影响

微量元素是机体必需的组成成分，对调节机体体液的pH值和维持稳定的渗透压具有重要的作用；另外，微量元素对应激反应中激素的合成和分泌、能量代谢、蛋白质合成、抗氧化以及免疫功能发挥都有重要作用[20～22]。血清中无机离子含量对牛的正常生理代谢具有重大意义。本研究发现热应激期间，荷斯坦牛和西荷杂交牛血清Cl-均显著升高，其原因可能是在热应激早期，由于环境温度变化，引起机体呼吸中枢兴奋，使得呼吸频率加快，血液CO2浓度下降，导致呼吸性碱中毒，从而使得肾分泌碳酸氢盐的能力增强，肾小管对Cl-的吸收增加，最终导致血清中Cl-含量增加[23]。这与Arad等[24]研究的热应激对鸡血清电解质含量影响的结果基本一致，说明热应激影响了机体电解质平衡。

3.4 持续热应激对试验牛血清抗氧化指标的影响

正常生理状态下，机体自由基的产生和消除处于动态平衡[25]。平衡一旦被打破，过高的自由基将会导致脂质过氧化物反应，产生丙二醛(MDA)，从而造成细胞损伤。SOD是一种含有金属元素的活性蛋白酶，能及时修复因自由基造成的损伤，是机体清除自由基的首要物质。GSH-PX是机体内一种重要的过氧化物分解酶，能还原有毒的过氧化物，从而保护细胞膜的结构及功能不受过氧化物的干扰及损害。刘吉生等[26]研究证明，机体T-AOC活性越高，对自由基清除能力越强，机体发生氧化损伤的几率就越低。本试验研究发现非热应激期和持续热应激阶段对西荷杂交牛和荷斯坦牛抗氧化能力的影响类似；热应激早期西荷杂交牛的TAO-C、SOD活性均显著高于荷斯坦牛（P＜0.05），在热应激后期西荷杂交牛MDA水平显著低于荷斯坦牛（P＜0.05），而GSH-PX和SOD水平显著高于荷斯坦牛。由此可知，西荷杂交牛相比荷斯坦牛对自由基的清除能力及还原过氧化物的能力更强，故前者的抗氧化能力在热应激期高于后者。

3.5 持续热应激对试验牛血清内分泌激素和HSP70的影响

肾上腺是动物体内对环境温度(尤其是高温)最为敏感的内分泌腺。下丘脑-垂体-肾上腺皮质轴(HPA)的激活并引起的糖皮质激素(皮质醇、皮质酮、皮质素)分泌量增加，都是应激反应最重要的特征。COR是肾上腺皮质合成分泌的一种类固醇激素，参与机体多种代谢过程，有利于组织的修复。本试验结果表明，持续热应激导致荷斯坦牛和西荷杂交牛血清中COR含量显著下降，这与宋小珍等[27]研究的热应激对肉牛血清内分泌激素含量影响的结果基本一致。本试验还发现非热应激期、热应激前期和热应激中期西荷杂交牛的COR显著高于荷斯坦牛。Alderman等[28]报道，HSP70与环境温湿度变化密切相关，在生物热耐受中起着主要作用。在环境变化应激时，产生的HSP70可以增强细胞对下一次有害损伤的耐受程度，维持细胞的正常生理功能代谢，提高细胞生存率。陈强等[29]报道，热应激状态时，奶牛体内HSP70基因的表达量会增加，说明HSP70基因的表达对机体耐热力的产生有重要的作用。HSP70在正常细胞内表达量较低或者不表达，但是在热应激或者其他应激源的作用下，表达量迅速增加。本试验结果显示，热应激期间西荷杂交牛的HSP70显著高于荷斯坦牛，显示了西荷杂交牛具有的耐热性。