大通牦牛TLR2基因序列特征分析

彭帅，陈朗，郑天宇，陆会宁，张丽，刘丽霞

（西北民族大学生命科学与工程学院，兰州 730030）

Toll样受体（Toll-like receptors，TLRs）位于单核/巨噬细胞等免疫细胞表面，同时也表达于上皮/牛胚气管细胞等非免疫细胞中，能识别细菌、病毒、寄生虫等多种病原微生物，是动物机体重要的模式识别受体[1,2]。自Medzhitov等[3]发现第一个TLRs以来，至今已有10余个家族成员[4]。它们通过感知病原微生物（如细菌、真菌等）表达的特异性结构，即病原分子相关模式（PAMPs）和某些内源性配体，传导病原微生物入侵信号并释放炎症因子等免疫活性物质，诱导机体产生固有免疫应答，进一步激活适应性免疫应答[5]。TLR2是一种跨膜糖蛋白，能够识别病原体的细胞壁成分，激活免疫细胞内的信号传导机制，使机体产生抗病性。目前，已经证实牛TLR2基因被定位于17号染色体上[6]。TLR2作为固有免疫和适应性免疫之间的桥梁，在机体中发挥着重要作用[7]，成为牛抗病育种的候选标记基因。

近年来，研究者对牛TLR2基因的结构功能、多态性及其与疾病的相关性做了大量研究。孙丽萍等研究表明，牛TLR2存在3个突变位点[8]。林宝山等利用荧光定量PCR，研究发现TLR2基因在牦牛小肠中有高表达现象[9]，且TLR2能识别并结合牛肠中的微小隐孢子虫[10]。董慧敏[11]、叶小康[12]研究发现，病原微生物感染奶牛子宫后TLR2基因mRNA表达量明显增加，并分析了其与子宫内膜炎的关联性。Bhaladhare等发现牛TLR2基因存在3个SNP位点，并分析了其与结核病的相关性[13]。这些研究表明TLR2基因与许多免疫性疾病有关联，并在调控免疫机理方面具有重要作用。

目前，有关大通牦牛TLR2基因的生物信息学研究还未见报道，为进一步探究其功能和作用机理，本研究采用DNA混合池扩增后直接测序的方法获得大通牦牛TLR2基因CDS区（编码区Coding regions），并利用生物信息学软件及网站预测分析大通牦牛TLR2蛋白的结构功能，为揭示该基因的基本性质和功能信息以及大通牦牛的抗病育种提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验血样

本研究的试验血样采自青海大通牦牛种牛场的55头大通牦牛，对其进行颈静脉采血，采全血10mL，加ACD抗凝剂抗凝，利用传统的苯酚-氯仿法抽提基因组DNA[14]。大通牦牛基因组DNA以0.8%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2 引物设计与合成

参考GenBank数据库中已发表的奶牛TLR2基因序列（登录号AF368419），并引用周峰等已经设计好的TLR2基因特异性引物[15]，分成五段进行扩增，预期扩增片段长度分别为522bp、822bp、574bp、526bp、599bp（表1）。引物由苏州金唯智生物科技有限公司合成。

表1 大通牦牛TLR2基因CDS区引物序列

1.3 DNA混合池构建与PCR扩增

55个大通牦牛基因组DNA样品各取2μL，构建一个DNA混合池，以DNA混合池为模板进行扩增。扩增体系为20μL：DNA模板0.8μL，上下游引物各0.4μL，2×Power Taq PCR Master Mix 11μL，ddH2O 7.4μL。PCR条件：94℃ 5min预变性，94℃ 30s变性，58.5℃ 30s退火，72℃ 50s延伸，30次循环，72℃10min延伸，4℃保存。PCR扩增产物以1%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.4 序列测定与拼接

五段PCR产物直接送苏州金唯智生物科技有限公司进行纯化后双向测序，并使用MEGA6软件[16]对大通牦牛TLR2基因CDS区进行拼接。

1.5 生物信息学分析

利用生物信息学软件及网站对大通牦牛TLR2蛋白结构、功能等进行预测与分析，所用软件及网站见表2。

表2 生物信息学分析网站及软件

2 结果与分析

2.1 大通牦牛TLR2蛋白理化性质预测分析

利用BioEdit软件和ExPASy的在线程序Protparam预测TLR2蛋白的分子式、相对分子质量、等电点和氨基酸组成等基本性质（表3）。结果显示，大通牦牛TLR2基因编码784个氨基酸，20种氨基酸占比见图1，亮氨酸（Leu）最多，占总氨基酸的15.43%，甲硫氨酸（Met）占比最少（1.40%）。

表3 大通牦牛TLR2蛋白质理化性质

图1 大通牦牛TLR2蛋白质氨基酸组成

2.2 大通牦牛TLR2跨膜结构预测分析

应用TMHMM Server V.2.0分析跨膜结构。结果显示，大通牦牛TLR2蛋白可能是由胞外区（1～587aa）、跨膜区（588～610aa）、胞内区（611～784aa）三部分组成的跨膜蛋白（图2）。利用CDD工具[22]预测TLR2蛋白膜外区富集亮氨酸重复序列，可辅助识别病原微生物。

图2 大通牦牛TLR2蛋白跨膜结构预测

2.3 大通牦牛TLR2蛋白信号肽预测分析

运用Signal P4.1软件预测大通牦牛TLR2蛋白的N端信号肽及剪切位点，其准确度可达96%[23]。结果显示，Cmax（0.692）、Ymax（0.800）均趋向于+1，S值在剪切位点之前连续偏高，剪切位点之后急剧降低，说明大通牦牛TLR2具有信号肽，剪切位点存在于20～21位氨基酸之间（图3）。

图3 大通牦牛TLR2信号肽预测

2.4 大通牦牛TLR2蛋白N-糖基化位点预测分析

图4 大通牦牛TLR2蛋白N-糖基化位点预测

利用CBS的在线程序NetNGlyc预测大通牦牛TLR2蛋白的N-糖基化位点（图4）。结果显示，TLR2蛋白具有3个潜在的N-糖基化位点，分别为114位点、199位点和442位点。

2.5 大通牦牛TLR2 mRNA二级结构

利用在线程序（RNA fold web server 服务器）预测大通牦牛TLR2 mRNA二级结构（图5）。结果显示，其自由能为-677.40 kcal/mol，与荷斯坦牛二级结构自由能相差微小，但二级结构构型发生明显变化[24,25]。

图5 大通牦牛TLR2 mRNA二级结构

3 讨论

TLR2作为TLRs的家族成员之一，活性居于前列，可与其他TLRs（如TLR1、TLR6）以及受体（如CD14）结合，产生强烈的免疫效应。目前国内外对于人及荷斯坦牛、鼠、鸭和羊等动物TLR2基因的研究已有大量报道[24～28]。

本研究通过蛋白质的理化性质、跨膜结构、信号肽、糖基化位点和mRNA二级结构分析TLR2基因的结构及功能。从预测结果看，TLR2蛋白是由784个氨基酸组成的不稳定亲水性跨膜蛋白质。大通牦牛TLR2蛋白理论等电点为6.46，由此可判断大通牦牛TLR2蛋白是一种弱酸性蛋白质。研究表明蛋白质不稳定指数大于40为不稳定蛋白，反之则为稳定蛋白[29]，大通牦牛TLR2蛋白不稳定指数为42.22，属于不稳定蛋白。依据总平均亲水性（-0.120），可判断大通牦牛TLR2蛋白是可溶性蛋白。通常蛋白质半衰期越长其结构越稳定，大通牦牛TLR2蛋白半衰期为30h，但其却是不稳定蛋白，可能由于不同基因发挥不同功能而产生的相反结果。大通牦牛TLR2蛋白是由胞外区、跨膜区、胞内区构成的跨膜蛋白，与南阳黄牛TLR2蛋白组成一致[15]。研究表明牛TLR2可通过NF-Κb途径诱导白细胞介素-1β的产生[30]，大通牦牛TLR2蛋白可能含有20个氨基酸组成的信号肽，南阳黄牛TLR2蛋白含有21个氨基酸组成的信号肽[15]，差别可能由于TLR2在不同种属之间指导蛋白质跨膜转移及分泌的功能强度差异所造成。蛋白质糖基化修饰对蛋白质折叠、分选及其定位有重要影响，大通牦牛TLR2蛋白具有3个潜在的N-糖基化位点，可能与其抗病性有关联。mRNA二级结构同荷斯坦牛有明显变化，可能与其优越的抗寒性有关联。

本研究对大通牦牛TLR2蛋白的理化性质和功能结构进行了预测分析，此后可在此基础上深入研究TLR2基因的相对表达量，为大通牦牛的抗病育种提供理论基础。