鯷鱼—小麦面筋交联蛋白前期酶解条件的研究

方超逸 林建城

摘要：异源蛋白交联载药体在药物缓释领域将有广阔的应用前景，本文则是以鯷鱼与小麦面筋共容蛋白为原料，选取水解度最高、可溶性蛋白最高、挥发性盐基氮最低为实验指标来确定鯷鱼蛋白与小麦面筋蛋白的酶解条件，为后期两者的交联构建寻找最优条件.结果表明，小麦面筋蛋白在胰酶酶解36h后，其水解度（DH）为最高12.39%，可溶性蛋白含量（PDI）也处于最高值49.03%，且挥发性盐基氮（TVB-N）最低为1.13%；在碱性蛋白酶（Alcalase）酶作用下除水解度较低外，其他两个指标测定值也相对满足本次实验的要求；因此可选择其作用小麦面筋蛋白制备交联反应的酶解液原料.鯷鱼蛋白在自身内源酶酶解2小时后，其可溶性蛋白与挥发性盐基氮都趋于较平缓，分别约为9.42%和1.2%；而水解度呈相对较大的上升趋势，为了使后续实验得到较理想结果，后期将选择鯷鱼蛋白酶解0、2h、4h、6h的酶解液分别与小麦面筋蛋白在胰蛋白酶、Alcalase酶酶解36时的酶解液进行TG交联.

关键词：鯷鱼蛋白；小麦面筋蛋白；酶解；最优条件

中图分类号：TS201.1 文献标识码：A 文章编号：1673-260X（2019）03-0042-06

1 概述

随着生物技术及缓释技术领域的不断拓展，异源蛋白交联载药体在药物缓释领域将有广阔的应用前景.国内外的研究报道中，虽然也有一些生物大分子在药物载体构建的报道[1]，但目前对于构建异源蛋白药物载体的研究和报道相当有限，在有限的报道研究也存在不够深入、制备方法也不够全面的问题，药物载体的靶性不够明确，所以有待于寻求更新颖安全的技术方法制备更能满足要求的药物载体.

本课题组拟利用转谷氨酰胺酶（TGase）将鯷鱼与小麦面筋共容蛋白酶解物共价交联构建药物的核壳材料，分析比较交联前后物质结构和性质的变化，寻找交联构建的最优条件.而本文研究的目的是以鯷鱼与小麦面筋共容蛋白为原料，对鯷鱼蛋白和小麦面筋蛋白酶解条件进行初步的确定，为后期两者的交联构建寻找最优条件.

鳀鱼是鳀属（Engraulis）鱼类的统称，是世界上单一渔业品种产量最高的鱼种，主要分布于南北半球的温带水域，我国的黄海和东海海域含有丰富的鳀鱼资源.鯷鱼营养价值高，其富含蛋白质，蛋白质含量达15%-20%，各种必需氨基酸齐全.其中利用酶水解加工所得的鳀鱼制品各方面性能都较为优越.鯷鱼酶解物含有丰富的必需氨基酸，占总氨基酸的38%，此外还含有较多的赖氨酸（Lys）[2].当前对酶解鯷鱼的研究主要集中在两个方面[3]：（1）确定酶解的条件及其产物的功能特性.（2）营养价值及生理活性.迄今为止，基于现今鳀鱼资源的深度加工利用尚处于空白的阶段，本次实验选择鯷鱼蛋白的酶解物为研究对象，确定鳀鱼的酶解条件，以期研究获得更广阔的利用途径.

小麦面筋蛋白又称谷朊粉[4]，是从小麦粉提取出来的天然蛋白质，属于小麦淀粉加工的副产物.谷朊粉的主要成分是蛋白质，含量约为70%-80%，且氨基酸组成比较齐全，钙磷铁等矿物质含量较高，此外还含有少量淀粉、纤维素、糖、脂肪等.在我国，谷朊粉的研究仍处于初级阶段，主要应用在食品领域，具有较高附加值的利用几乎没有，因此开发谷朊粉新用途势在必行.而溶解度是小麦面筋蛋白应用于食品生产中首要考虑的问题.原因是溶解度对面筋蛋白的提取、纯化、分离及加工条件的确定至关重要.通过改性修饰来提高面筋蛋白溶解度和相应的功能特性是目前一项重要的研究工作.现今面筋蛋白的改性方法研究主要集中在物理方法、化学方法、酶法及基因工程法这四个方面[5].目前应用较为广泛的是酶解法.

鯷鱼蛋白含有丰富的赖氨酸，可以弥补小麦面筋蛋白的营养缺陷，并且有利于形成G—L键，本次课题研究的目的是以鯷鱼与小麦面筋共容蛋白为原料，对鯷鱼蛋白和小麦面筋蛋白酶解条件进行初步的确定，为后期两者的交联构建寻找最优条件.课题研究拟开展的几个主要方面内容：

（1）小麦面筋蛋白酶解条件的确定以及对其水解度、蛋白质回收率、挥发性盐基氮的测定.

（2）鯷鱼蛋白酶解条件的确定以及对其水解度、蛋白质回收率、揮发性盐基氮的测定.

目前国内外尚无异源蛋白水解物共价交联构建药物载体控释体系的研究报道，并且对于生物大分子纳米药物载体的研究尚处在基础阶段.因此，通过本研究的工作，可促进谷物和海洋低值蛋白综合利用与开发，对其在生物医院领域进行高附加值开发具有重要的意义.

2 材料与方法

2.1 实验材料与仪器设备

市售谷朊粉、鲜鳀鱼（莆田市永辉超市提供），各种酶制剂及仪器如表2-1和2-2所示.

2.2 实验方法

2.2.1 鯷鱼酶解液的制备

由于鯷鱼自身含有较为丰富的内源自溶酶，故在一定条件下会水解自身蛋白.为了避免添加外源酶而增加成本，因此本次研究选择利用鯷鱼内源酶进行蛋白的酶解.

2.2.1.1 样品前处理

鯷鱼去掉头、尾、刺、鳞，挖出内脏，用清水洗净，取肉，搅成鱼糜，用密封袋分装，冷冻保藏，备用.

2.2.1.2 鯷鱼酶解方法

将鱼糜与水按质量比1：1混合，酶解温度为55℃，自然pH值.酶解时间设置为0h、2h、4h、6h、8h.酶解不同时间后，取一定量的酶解液，沸水灭酶10min，冷却后，4℃离心20min（10000r/min），取上清液，4℃冰箱保存备用.

2.2.2 小麦面筋蛋白酶解液的制备

本次研究利用各种蛋白酶对其进行酶解制备小麦面筋蛋白酶解物，测定分析后从而确定酶解条件，为后面药物载体的构建做好前期的材料准备.

2.2.2.1 柠檬酸脱酰胺处理

称取6.00g柠檬酸，用蒸馏水溶解，定容于1000 mL的容量瓶，配置成质量浓度0.6%的柠檬酸溶液.称取10g小麦面筋蛋白粉与100mL柠檬酸溶液混合均匀，配制一定浓度的小麦面筋蛋白分散悬浮液，并制作五组平行实验.

2.2.2.2 小麦面筋蛋白酶解方法[6]

将上述进行脱酰胺处理后的五组实验用0.1 mol/L的NaOH调pH分别为6.0、8.5、7.0、9.0、9.0.置于50℃水浴恒温振荡器30min.取出按调节的pH顺序分别添加木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶（Alcalase）、风味蛋白酶、胰蛋白酶、水解蛋白酶（Novozyme），添加酶量为1%（按蛋白质质量计）进行酶解.酶解时间设置为0h、12h、24h、36h、48h.酶解不同时间后，取一定量的酶解液，沸水灭酶10min，冷却后，4℃离心15min（10000r/min），取上清液，4℃冰箱保存备用.

2.2.3 水解度的测定（Degree of hydrolysis，DH）[7]

蛋白质的水解度（DH）是指蛋白质水解中断裂的肽键数占肽键总数的百分比，本实验采用茚三酮法测定.

制备茚三酮显色剂：茚三酮0.5g，果糖0.3g，Na2HPO4·10H2O 10.0g，KH2PO4 6.0g，定容至100mL；

标准曲线的绘制：准确称取0.1000g干燥过的甘氨酸溶解后定容至100mL，取出2.00mL定容至100mL得20ug/mL的溶液.取12支试管分两组，分别加入0.0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0mL的标准溶液，用蒸馏水补足到2mL；加入1.00mL显色剂，摇匀后沸水浴中加热15min；冷却后加入5.00mL 40%乙醇溶液，混匀，放置15min；用1cm比色杯以空白管调零于570nm处测定吸光度.取两组测定的平均值，以光吸收值为横坐标，蛋白质的含量（ug/mL）为纵坐标绘制标准曲线.

水解蛋白液中-NH2基的测定：取水解蛋白液0.5mL定容至50.0mL；取0.40mL稀释液于试管中，加入1.60mL蒸馏水、1.00mL显色，摇匀后沸水浴中加热15min；冷却后加入5.00mL 40%乙醇溶液，混匀，放置15min；每种样液做两次平行，同时做空白试验，以空白管调零于570nm处测定吸光度.利用标准曲线计算水解蛋白液中-NH2基的含量（umol/mL）.

DH=（h-h0）/htot*100%

DH=（Y/（6.25*N）-h0）/htot*100% 公式2-1

h&Y-单位质量蛋白质中被水解的肽键的量（mmol/g）；

htot-单位质量蛋白质中肽键的总量（mmol/g）；对于某一特定蛋白质来讲是一个常数，查得小麦蛋白htot=9.2mmol/g；

N-氮的摩尔质量，14.008g/mol.

2.2.4 可溶性蛋白的测定[8]

标准蛋白质溶液：准确称取标准的结晶牛血清蛋白0.5g，加蒸馏水溶解后定容至50mL，配制成10mg/mL的标准蛋白质溶液.

双缩脲试剂：准确称取硫酸铜1.50g，酒石酸钾钠6.0g，用500mL蒸馏水溶解，在搅拌下加入300mL 10%NaOH溶液，用水稀释到1000mL，贮存于塑料瓶中（或内壁涂以石蜡的瓶中）.

标准曲线的绘制：取12支试管分两组，分别加入0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL的标准蛋白质溶液，用水补足到1.0mL；加入4mL双缩脲试剂，充分摇匀，在室温下放置30min；用未加蛋白溶液的一组作为空白对照液，于540nm处进行比色测定.取两组测定的平均值，以光吸收值为横坐标，蛋白质的含量（mg/mL）为纵坐标绘制标准曲线.

水解液中可溶性蛋白的测定：取水解蛋白液0.2mL，加入蒸馏水补足到1mL；加入4mL双缩脲试剂，充分摇匀，在室温下放置30min；每种样品做两组平行，同时做空白试验，以空白管调零于540nm处测定吸光度.利用标准曲线计算水解蛋白液中可溶性蛋白的含量（mg/mL）.

小麦蛋白的溶解度用分散指数（PDI）来表示：

PDI=（C*V*N）/W*100% 公式2-2

C-被測蛋白质的浓度，mg/mL；

V-被测蛋白质总体积，mL；

N-稀释倍数；

W-蛋白质样品的质量，g.

2.2.5 挥发性盐基氮的测定[9]

分析使用仪器：DWS-296型氨氮分析仪，DWS-296-1型测量单元，电极：pNH3-3型氨电极.

2.2.5.1 溶液的配制

无氨水制备：按每升去离子水中加入0.1mL硫酸（r=1.84g/mL）的比例，用一个全玻璃装置进行蒸馏.最初蒸馏的50mL馏出液废弃不要，余下的馏出液收集在有密闭玻璃塞的玻璃容器中，每升馏出液加入10g强酸性离子交换树脂（氢型）.

清洗剂：将0.5克清洗剂，转入1000mL容量瓶中，加超纯水稀释至刻度.

（浓）掩蔽剂：将800g掩蔽剂，转入1000mL容量瓶中，加超纯水稀释至刻度.

（稀）掩蔽剂：将10g掩蔽剂，转入1000mL容量瓶中，加超纯水稀释至刻度.

碱化剂：将10g氢氧化钠，转入1000mL容量瓶中，加超纯水稀释至刻度.转移到密封性能良好的聚乙烯瓶中，密闭保存.

氨氮标准母液（1000mg/L）：称取（3.819±0.004）g氯化铵（NH4Cl，经100℃～105℃干燥2h）转入1000mL容量瓶中，加无氨水稀释至刻度.配制成的氨氮标准母溶液与有证氨氮标准溶液比对相对误差应不超过±1.5%.

100mg/L氨氮标准溶液：吸取100.0mL氨氮标准母液，转入1000mL容量瓶中，加无氨水稀释至刻度.

15.00mg/L氨氮标准溶液：吸取15.00mL氨氮标准母液，转入1000mL容量瓶中，加无氨水稀释至刻度.

1.50mg/L氨氮标准溶液：吸取1.50mL氨氮标准母液，转入1000mL容量瓶中，加无氨水稀释至刻度.

2.2.5.2 实验步骤

利用二点标定法进行测定：

样品测量：

仪器完成二点标定及空白清洗后，将（清洗剂/样品）吸管用蒸馏水冲洗干净后放入样品混合溶液中（取50.00mL样品溶液加（浓）4.00mL掩蔽剂混匀），泵开关置“开”，（清洗/测量）开关置“测量”，待仪器显示屏上的读数趋于稳定，记录该读数，即完成样品浓度测量.

3 结果与讨论

3.1 DH的测定结果

3.1.1 茚三酮法DH的标准曲线

以吸光度为横坐标，甘氨酸的浓度为纵坐标，绘制标准曲线如图1所示，得出水解蛋白液中-NH2基的量Y（mg/L）=22.427A-0.0923（R2= 0.9993）；因甘氨酸的分子量为75.07，所以式子可转化为Y（umol/L）=0.2987A-1.23*10-3，Y用于DH的计算.

3.1.2 酶解时间对鯷鱼蛋白水解度的影响

鯷鱼在自身内源酶酶解后分解为小分子的肽、氨基酸，水解度的高低可反映蛋白质的降解程度.图2所示的是鯷鱼蛋白随不同的酶解时间水解度的变化情况.从图中可知，随着酶解时间的的增加，鯷鱼蛋白的水解度越来越高.在反应初期（0-2h内），水解度上升的幅度最大，DH由3.16%上升至6.43%.这是因为酶的催化速度会受到产物的影响，反应初期，产物的抑制作用小，水解度上升的较快，随着反应时间的延长，酶活力逐渐下降，且游离的小分子肽和氨基酸等产物增多，产物的抑制作用增加，水解度上升的趋势较慢，最后由于底物的减少，水解度基本保持不变，但总体还是呈现上升的动态.

3.1.1 不同蛋白酶对小麦面筋蛋白水解度的影响

由图3可知：对小麦面筋蛋白进行深度酶解，胰蛋白酶酶解小麦面筋蛋白的DH%最高，高达13.12%，其次是风味蛋白酶12.56%，且随时间的延长水解度上升的趋势都较为显著.碱性蛋白酶（Alcalase）酶解的水解度最低.在胰蛋白酶作用下，反应12h内，水解度上升的速率最快，随着反应时间的延长，水解度趋于平缓，水解36h后，水解度增加的幅度不大，基本保持不变.

3.2 可溶性蛋白的测定结果

3.2.1 可溶性蛋白质测定的标准曲线

以吸光度为横坐标，蛋白质浓度为纵坐标，绘制标准曲线见图4，得到回归方程为：Y=20.185X -0.0884（R2=0.9993）.

3.2. 2酶解时间对鯷鱼蛋白溶解度（PDI）的影响

如图5可知：随着酶解时间的增加，鯷鱼蛋白溶解度逐渐上升，在0-2h内变化得最明显，溶解度由5.14%变为9.42%，在反应时间为2-8h内，溶解度上升较缓慢，趋于平稳.

3.2.3 不同蛋白酶对小麦面筋蛋白PDI%的影响

小麦面筋蛋白主要是麦谷蛋白和麦醇溶蛋白，它们在中性条件下几乎不溶，在酶解的过程中，溶液的pH会发生变化，从而溶解度也会相应地发生改变.酶解物溶解度提高的原因主要是酶解过程中分子量减小，暴露更多的离子化氨基和羧基，端基极性基团增加，提高了酶解产物的亲水性，从而大大增加了蛋白质的溶解度.

由图6可见：胰蛋白酶酶解小麦面筋蛋白的PDI%最高，高至53.37%，其次是碱性蛋白酶（Alcalase）47.35%，接下来依次是水解蛋白酶（Novozyme）、木瓜蛋白酶、风味蛋白酶.在酶解初期（0-12h内）小麦面筋蛋白的溶解度上升速率最大，随后曲线都趋于平缓.可能在反应初期，溶液的pH变化不大，对蛋白溶解度的影响较小，而随着酶解的进行，溶液pH变化较明显，对蛋白溶解度的影响增大，所以蛋白溶解度的变化较为缓慢.在风味蛋白酶的作用下，酶解的pH为7.0，小麦面筋蛋白在此pH中，溶解度极小，在酶解过程pH的变化中，蛋白质的溶解度也是不高，所以相對于其他酶的作用下，其酶解的小麦面筋蛋白的溶解度最低.

3.3 挥发性盐基氮的测定

3.3.1 酶解时间对鯷鱼蛋白的挥发性盐基氮的影响

如图7所示：酶解时间0-2h内，鯷鱼蛋白的挥发性盐基氮上升的速度较为缓慢，由0.58g/mL增加到0.75g/mL，而在2-4h内，上升的趋势较明显，挥发性盐基氮由0.75g/mL增加至1.20g/mL，其后，曲线趋于平缓，酶解液中的TVB-N值基本保持不变.由于反应初期，鯷鱼蛋白在自身内源酶作用，蛋白质被分解产生具有挥发性的氨以及胺基等碱性含氮物质，所以测得的挥发性盐基氮逐渐增加；随着酶解的进行，酶解液中微生物不断增多，在某些细菌的作用下，加速了蛋白质的分解，导致在反应2-4h内挥发性盐基氮上升的速率明显增加；随着酶解底物的减少，到最后曲线趋于平缓.

3.3.2 不同蛋白酶对小麦面筋蛋白挥发性盐基氮的影响

由图8可知：随着酶解的进行，小麦面筋蛋白酶解液中的挥发性盐基氮的含量基本呈现上升的趋势.在酶解12小时内，胰酶的上升速率最快，在酶解12小时后趋于平缓，基本保持不变，说明胰酶在反应初期的酶解活性最高，随着酶解过程中溶液pH的变化以及底物含量的减少，挥发性盐基氮含量上升速率较少，到最后保持稳定；在木瓜蛋白酶的作用下，酶解12小时后仍然处于较大的上升速率直至24后，曲线趋于平稳，上升幅度很小，说明木瓜蛋白酶在反应24h内能保持较高的的酶活；而在碱性蛋白酶（Alcalase）酶解下，曲线一直呈现缓慢上升的趋势，在酶解36小时时与胰酶有一个交点，此时两种酶作用的酶解液中挥发性盐基氮含量相同，说明碱性蛋白酶（Alcalase）在整个反应过程中，酶活最低，分解蛋白速度最慢，直至36h后才出现缓慢的提升，此时挥发性盐基氮高于胰酶作用.

4 结果分析

由于转谷氨酰胺酶是催化蛋白质中赖氨酸残基上的ε-氨基和谷氨酰胺残基上的γ-羟酰氨基之间结合反应的酶，所以蛋白的水解度越高，肽键断裂的程度越高，鯷鱼蛋白暴露出赖氨酸残基上的ε-氨基与小麦面筋蛋白暴露出的谷氨酰胺残基上的γ-羟酰氨基将增多，有利于交联作用；且可溶性蛋白含量高有利于增加酶解液中氨基酸的溶度，促进交联反应；而酶解过程产生的挥发性盐基氮主要是氨以及少量伯胺和叔胺等物质，会阻碍交联的进行[10].因此本次实验选取水解度最高、可溶性蛋白最高、挥发性盐基氮最低为实验指标来确定鯷鱼蛋白与小麦面筋蛋白酶解条件.对于小麦面筋蛋白酶解过程，酶解36h时，其水解度、可溶性蛋白都趋于较大值，而此时挥发性盐基氮处于较低值.小麦面筋蛋白在各种蛋白酶的作用下酶解36h的水解度、可溶性蛋白含量、挥发性盐基氮含量如表1所示.

由表1可看出，小麦面筋蛋白在胰酶酶解36h后，其水解度与可溶性蛋白含量都处于最高值，且挥发性盐基氮最低.在Alcalase酶作用下除水解度较低外，其它兩个指标测定值也相对满足本次实验的要求，因此可选择其作用小麦面筋蛋白制备交联反应的酶解液原料.所以初选择小麦面筋蛋白的酶解的酶的种类为胰酶、碱性蛋白酶（Alcalase），酶解时间为36小时，其余酶解条件与2.2.2所示一样.

由于鯷鱼蛋白在自身内源酶酶解2小时后，其可溶性蛋白与挥发性盐基氮都趋于较平缓，而水解度呈相对较大的上升趋势，为了使后续实验得到较理想结果，因此在后期的研究中将选择鯷鱼蛋白酶解0、2h、4h、6h的酶解液分别与小麦面筋蛋白在胰蛋白酶、碱性蛋白酶（Alcalase）酶解36时的酶解液进行TG交联.

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