烤烟不同种植施肥模式对土壤养分、酶活性及细菌多样性的影响

陈浩 魏立本 王亚麒 黄建国 赵建 张长华

摘要：【目的】研究不同種植施肥模式对土壤养分、酶活性及细菌多样性的影响，为黔北烟区土壤的可持续利用提供科学依据。【方法】设烤烟—烤烟—黑麦草连作+单施化肥（C-CF）、烤烟—烤烟—黑麦草连作+有机肥化肥配施（C-CFM）、烤烟—玉米—黑麦草轮作+单施化肥（R-CF）和烤烟—玉米—黑麦草轮作+有机肥化肥配施（R-CFM）4种种植施肥模式处理，通过常规分析和高通量测序技术研究不同处理的土壤养分、酶活性及细菌多样性变化。【结果】经过13年的种植施肥后，C-CF、C-CFM和R-CF处理的土壤pH和有机质含量显著降低（P<0.05）;R-CFM处理的土壤pH和有机质无显著变化（P>0.05，下同）;各处理的土壤有效磷和有效钾含量增加，有效氮含量降低。土壤过氧化氢酶、蔗糖酶、脲酶和磷酸酶活性及微生物量碳、氮均以R-CFM处理相对较高。轮作和施用有机肥改善了土壤的生态环境，使微生物种群增加、活性增强，细菌群落的丰富度指数（Chao1）、均匀度指数（Heip）和多样性指数（Shannon）均表现为C-CF处理<C-CFM处理<R-CF处理<R-CFM处理，优势度指数（Simpson）表现为C-CF处理>C-CFM处理=R-CF处理>R-CFM处理。土壤细菌门类和优势菌属的相对丰度因种植施肥模式不同而存在差异，但各处理的主要优势种群基本一致，且绝对优势菌属均为厌氧绳菌（Uncultured Anaerolineaceae）、酸杆菌亚群-6（Acidobacteria Subgroup-6）、玫瑰弯菌属（Roseiflexus）和鞘脂单胞菌属（Sphingomonas）。【结论】采用轮作和有机肥化肥配施的种植施肥模式，土壤pH稳定，有机质、微生物生物量、土壤酶活性及细菌多样性指数等较高，有益于作物高产优质，并保持土壤健康质量，是一种用养结合的种植施肥模式，值得在黔北烟区推广应用。

关键词： 烤烟;轮作;有机肥;土壤养分;土壤酶活性;细菌多样性

中图分类号： S572                             文献标志码： A 文章编号：2095-1191（2019）05-0982-08

Abstract：【Objective】The effects of different planting and fertilization modes on soil nutrient，enzyme activity and bacterial diversity of tobacco were researched to provide scientific basis for the long-term sustainable utilization of toba-cco soils in northern Guizhou. 【Method】The treatments included tobacco-tobacco-ryegrass continuous cropping with che-mical fertilization（R-CF），tobacco-tobacco-ryegrass continuous cropping with chemical fertilizer application plus manure （R-CFM），tobacco-maize-ryegrass rotation with chemical fertilization（C-CF），tobacco-maize-ryegrass rotation with chemical fertilization plus manure（C-CFM）. Soil samples were taken and analyzed for nutrients，enzyme activities，and bacteria diversity by routine analysis and high throughput sequencing. 【Result】After 13 years of planting and fertilization，R-CF， C-CFM and R-CF cropping treatments made the soil pH and the content of organic matter decreased significantly （P<0.05）. Soil pH and organic matter of R-CFM did not change significantly（P>0.05，the same below）. The contents of available phosphorus and available potassium increased，but the contents of available nitrogen decreased. The activities of catalase，invertase，urease and phosphatase，microbial biomass carbon and nitrogen in soil were relatively higher in R-CFM than others. Rotation and application of manure improved soil ecological environment，increased microbial population and activity. Diversity index（Chao1）， evenness index（Heip） and diversity index（Shannon） all presented C-CF<C-CFM<R-CF<R-CFM，and dominance index（Simpson） was C-CF>C-CFM=R-CF>R-CFM. The abundances of soil bacteria and dominant bacteria varied with different fertilization modes，but the dominant populations of each treatment were basically the same，and the absolute dominant bacteria were uncultured Anaerolineaceae，Acidobacteria Subgroup-6，Roseiflexus and Sphingomonas. 【Conclusion】Crop rotation and chemical fertilization plus manure mode can result in stable pH， high organic matter， microbial biomass， soil enzyme activity and bacteria diversity index. As a planting fertilization pattern combining utilization and restoration， it is beneficial for the high yield and quality of crops and maintaining soil quality. Thus this method is worth promoting in tobacco plating areas in northern Guizhou.

Key words： tobacco; rotation; fertilization; soil nutrient; soil enzyme activity; bacteria diversity

0 引言

【研究意义】黔北烟区土地资源短缺，烤烟连作现象普遍。由于长期连作和不合理的施肥配比，导致土壤理化性状恶化，烤烟产质量大幅度降低，且烟草多种病原菌在土壤中大量积累，显著增加其后茬作物的致病率，严重影响了农业生产的可持续发展（贾志红等，2010）。有研究表明，在长期连作的土壤中，氮、磷、钾肥的平均利用率分别下降4.8%、7.0%和3.2%（邓阳春和黄建国，2010），且鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas paucimobilis）和芽孢杆菌属（Bacillus subtilis）等有益菌数量减少，微生物种群失衡，发生连作障碍（杜思瑶等，2017）。因此，研究长期不同的施肥方式及种植制度对植烟土壤养分、酶活性及细菌多样性变化的影响，对黔北烟区选择合理的种植施肥方式，调整种植结构，改善土壤状况及烟区土壤的可持续利用具有重要意义。【前人研究进展】不同的种植施肥模式可对土壤养分、酶活性及细菌多样性产生不同影响。合理轮作是克服烤烟连作危害的有效措施之一。烤烟与水稻（Oryza sativa）、玉米、油菜（Brassica napus）、苕子（Papilionaceae）、黑麦草等多种作物轮作均可显著增加土壤细菌多样性（时安东等，2011;段玉琪等，2012），而烤烟连作降低了根际土壤的细菌多样性（齐虹凌等，2015）。在烤烟—玉米长期轮作过程中，轮作土壤的pH及速效磷、速效钾含量显著高于连作土壤（张艳，2014）。陈丹梅等（2015）研究发现，烤烟与多种作物轮作时，轮作土壤中的过氧化物酶、过氧化氢酶、脲酶和转化酶活性及土壤pH均高于连作土壤。张笑宇等（2018）研究表明，轮作烟田根际土壤中可培养细菌和放线菌数量均高于连作烟田根际土壤，但真菌数量低于连作烟田。【本研究切入点】目前，烤烟与其他作物轮作的种植方式已有较多应用（张艳，2014;陈丹梅等，2015;张笑宇等，2018），但有关种植制度和施肥方式对烤烟及植烟土壤影响的研究较少;特别是在长期施肥的烤烟—玉米—牧草轮作条件下，对土壤理化生物学性质的研究鲜见报道;此外，土壤中栖息着种类繁多的微生物，长期种植施肥制度对土壤细菌群落变化特征的影响尚不明确。【拟解决的关键问题】以黔北烟区主要种植施肥模式为对象，利用常规分析和高通量测序技术，研究长期种植和施肥条件下土壤养分、酶活性和细菌的种群结构，为土地资源的可持续利用提供科学依据。

1 材料与方法

1. 1 试验地概况

试验地位于贵州省遵义市播州区中心科技园（东经106°56´，北纬27°32´），海拔900 m，属亚热带季风性湿润气候，年平均气温14.9 ℃，年均降水量1035 mm。长期定位试验点建于2004年，土壤类型为黄壤。初始土壤理化性质：pH 7.49、有機质21.24 g/kg、全氮1.16 g/kg、全磷1.08 g/kg、全钾16.81 g/kg、碱解氮94.76 mg/kg、有效磷19.10 mg/kg、速效钾196.82 mg/kg。

1. 2 试验材料

供试烤烟品种为K326和红花大金元;玉米品种为遵玉和黔单等试验当年大面积种植的品种;黑麦草品种为美国四倍体特高。

1. 3 试验方法

试验始于2004年，设烤烟—烤烟—黑麦草连作+单施化肥（C-CF）、烤烟—烤烟—黑麦草连作+有机肥化肥配施（C-CFM）、烤烟—玉米—黑麦草轮作+单施化肥（R-CF）和烤烟—玉米—黑麦草轮作+有机肥化肥配施（R-CFM）4种种植施肥模式处理。重复3次，随机排列。奇数年各小区种植烤烟，偶数年轮作小区种植玉米，冬季种植黑麦草。小区面积16 m2。

烤烟株行距1.1 m×0.6 m，基肥施用N 100 kg/ha、P2O5 75 kg/ha、K2O 200 kg/ha，基追比7∶3，追肥在移栽后第10 d和第40 d平均施用，基肥和追肥均为烤烟专用基肥（10-10-25）和追肥（15-0-30）;有机肥化肥配施处理中，有机肥为商品有机肥（N、P2O5、K2O含量分别为2.5%、0.75%和1.5%），有机肥氮∶化肥氮=1∶1，有机肥全作基肥，不足的养分由化肥补充。玉米株行距0.5 m×0.4 m，基肥施用N 100 kg/ha、P2O5 50 kg/ha、K2O 50 kg/ha，由复合肥（20-10-10）提供，在玉米拔节期和大喇叭口期分别追施化学氮肥N 10 kg/ha。冬季种植黑麦草，基施化学氮肥N 75 kg/ha。化学氮肥的氮、磷、钾分别由尿素、过磷酸钙和硫酸钾提供。烤烟、玉米和黑麦草的田间管理及烟叶的采收、烘烤、分级等均同当地高产优质技术规范。

1. 4 测定项目及方法

2017年烤烟栽种前收、获后及成熟期，采集烟垄两株烟中间0～20 cm 的土壤。采用常规分析方法测定土壤pH、有机质及有效氮、磷、钾养分等（杨剑虹等，2008）;采用靛酚蓝比色法、3，5-二硝基水杨酸比色法、磷酸苯二钠比色法和高锰酸钾滴定法分别测定土壤脲酶、蔗糖酶、磷酸酶和过氧化氢酶活性（薛立等，2002）;参考吴金水（2006）的方法进行微生物碳氮量测定，采用氯仿熏蒸—0.5 mol/L K2SO4提取，K2Cr2O7氧化法测定微生物量碳，腚酚蓝比色法测定微生物量氮。

取新鲜土壤，用E.Z.N.A.® Soil Kit 试剂盒（美国OMEGA公司）提取总DNA，1%琼脂糖凝胶电泳检测其完整性，NanoDrop 2000（赛默飞世尔科技有限公司）检测DNA纯度和浓度，GeneAmp®9700型（美国ABI公司）PCR仪扩增16S rDNA基因的V3～V4区，引物为338F（5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3'）和806R（5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'），2%琼脂糖凝胶电泳PCR产物，AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒（AXYGEN公司）切胶回收，Tris-HCl洗脱，QuantiFluor™-ST蓝色荧光定量系统（Promega公司）定量。送至上海美吉生物医药科技有限公司利用Illumina高通量测序平台进行测序（田地等，2013）。

1. 5 统计分析

测序结束后，对有效序列进行去杂、修剪、除嵌合体序列等过滤处理后得到优化序列，通过聚类分析形成操作分类单元（Operational taxonomic units，OTU），采用BLAST程序对比GenBank（http：//ncbi.nlm.nih.gov）中的已知序列，根据97%相似度确定16S rDNA基因序列对应的细菌属（种）名称。利用Mothur计算丰富度指数（Chao1）、均匀度指数（Heip）、多样性指数（Shannon）和优势度指数（Simpson）。利用Excel 2013进行数据的整理和基本计算，利用SPSS 18.0进行统计分析。

2 结果与分析

2. 1 不同处理对土壤pH、有机质及有效氮、有效磷、有效钾含量的影响

由图1可看出，与原始土壤相比，R-CFM处理的土壤pH和有机质含量无显著变化（P>0.05，下同），而C-CF、C-CFM和R-CF处理使土壤pH从7.49显著下降至7.11～7.32（P<0.05，下同），有机质显著减少8.3%～19.0%，尤以单施化肥的降幅最明显。种植施肥后，有效氮含量降低，以R-CFM处理降幅最大;有效磷和有效钾含量增加，分别以R-CFM和C-CF处理最高。

2. 2 不同处理对土壤酶活性的影响

由表1可知，脲酶活性以R-CFM处理最高，轮作表现为R-CFM处理>R-CF处理，连作表现为C-CF处理>C-CFM处理;磷酸酶活性以C-CF处理最低，其余3个处理间无显著差异;蔗糖酶活性表现为R-CFM处理最高，其次为C-CF处理，二者间无显著差异，但均显著高于R-CF和C-CFM处理;过氧化氢酶活性表现为R-CFM处理>C-CFM处理>R-CF处理>C-CF处理，其中前二者间无显著差异。

2. 3 不同处理对土壤微生物生物量的影响

由图2可看出，种植施肥显著影响土壤微生物量碳、氮及其比值。微生物量碳：同一种植条件下，有机肥化肥配施处理显著高于单施化肥处理;同一施肥条件下，轮作处理显著高于连作处理。微生物量氮：轮作土壤显著高于连作土壤，其中R-CF处理最高，R-CFM处理次之，二者无显著差异，C-CF处理最低。微生物量碳氮比：C-CF处理>C-CFM处理>R-CFM处理>R-CF处理。

2. 4 不同处理对土壤细菌群落多样性的影响

由表2可知，细菌群落的Chao1、Heip和Shannon指数均表现为C-CF处理<C-CFM处理<R-CF处理<R-CFM处理;Simpson指数表现为C-CF处理>C-CFM处理=R-CF处理>R-CFM处理。各项指数在R-CF和R-CFM处理间差异均不显著，而二者与C-CF处理的差异均达显著水平。

2. 5 不同处理对土壤细菌群落组成的影响

2. 5. 1 细菌门 如图3所示，在供试土壤中，相对丰度≥1.00%的细菌种群包括变形菌门（Proteobacteria）、放线菌门（Actinobacteria）、绿弯菌门（Chloroflexi）、酸杆菌门（Acidobacteria）、拟杆菌门（Bacteroidetes）等9个门类，合计占总量的92.86%～96.56%。此外，相对丰度<1.00%的细菌类群有Saccharibacteria、蓝藻门（Cyanobacteria）、浮霉菌门（Planctomycetes）和黏胶球形菌门（Latescibacteria）等。

在供试土壤中，相对丰度≥8.47%的优势菌株有变形菌门、放线菌门、绿弯菌门和酸杆菌门，合计占总量的79.76%～80.97%。在不同种植制度间，变形菌门和放线菌门的相对丰富度表现为连作高于轮作，绿弯菌门和酸杆菌门则相反;在同一种植制度不同施肥处理间，优势菌门的丰富度无显著差异。

2. 5. 2 细菌属 由图4可知，在供试土壤中，相对丰富度>1.00%的优势细菌共16个属（种），合计占总量的39.97%～44.23%。其中，不可培养的厌氧绳菌属（Uncultured Anaerolinea）、玫瑰弯菌属（Roseiflexus）、酸杆菌亚群-6（Acidobacteria Subgroup-6）和鞘脂单胞菌属（Sphingomonas）为绝对优势菌属。在连作土壤中，不可培养的厌氧绳菌属、玫瑰弯菌属、酸杆菌亚群-6、鞘脂单胞菌属、不可培养的芽单胞菌属（Uncultured Gemmatimonadaceae）、链霉菌属（Streptomyces）、硝化螺旋菌属（Nitrospira）、不可培养的酸微菌属（Uncultured Acidimicrobiales）为共有细菌;在轮作土壤中，酸杆菌亚群-6、不可培养的厌氧绳菌属、玫瑰弯菌属、未分类的蓝藻（Unclassified Cyanobacteria）、鞘脂单胞菌属、绿弯菌KD4-96（Chloroflexi KD4-96）、不可培养的芽单胞菌属、不可培養的酸微菌属、酸杆菌RB41（Acidobacteria RB41）、未分类的放线菌-2（Unclassified Actinobacteria）、黏球菌BIrii41（Myxococcales BIrii41）、硝化螺旋菌属、绿弯菌TK10（Chloroflexi TK10）为共有细菌。

在供试土壤中，C-CF处理的独有菌株包括不可培养的亚硝化单胞菌属（Uncultured Nitrosomonadaceae）、未分类的放线菌-1（Unclassified Gaiellales）、不可培养的拟杆菌属（Uncultured Cytophagaceae）和酸杆菌ABS-19（Acidobacteria ABS-19）;C-CFM处理的独有菌株包括不可培养的线杆菌属（Uncultured Thermosporotrichaceae）、节杆菌属（Arthrobacter）、慢生根瘤菌属（Bradyrhizobium）;R-CF和R-CFM处理无独有菌属。

种植施肥模式对优势细菌相对丰度的影响因菌属（种）不同而异，如连作土壤中，鞘脂单胞菌属的相对丰度显著高于轮作，有机肥化肥配施处理显著高于单施化肥处理;轮作土壤中，施肥对酸杆菌亚群-6无显著影响;但连作土壤中，有机肥化肥配施处理的相对丰度显著高于单施化肥处理。

2. 6 不同处理的土壤细菌种水平Venn分析结果

Venn分析结果（图5）表明，共有644种细菌普遍存在于各处理的土壤中，在C-CF、C-CFM、R-CF和R-CFM处理中还分别存在8、16、6和6种独有细菌。从不同种植制度来看，在轮作土壤中共存729种细菌，连作土壤中共存690种细菌;从不同施肥方式来看，单施化肥的土壤共存689种细菌，而有机肥化肥配施的土壤中共存722种细菌。说明经过多年种植施肥后，不同处理土壤中的细菌种群仍具有较高的相似性。

3 讨论

土壤pH和有机质与土壤理化生物学性质密切相关，是土壤肥力和健康质量的重要标志（王清奎等，2005）。经过13年的种植施肥，C-CF、C-CFM和R-CF处理的土壤pH和有機质显著降低，说明土壤发生酸化，土壤理化及生物学性质恶化，与王连君和谷思玉（2004）的研究结果一致;而R-CFM处理的土壤pH无显著变化，有机质含量增加，说明其土壤理化生物学性质有所改善，肥力提高。因此，在黔北烤烟种植区，提倡采用轮作及有机肥化肥配施的种植施肥模式，既有益于作物高产优质，又可促进土地资源的可持续利用。此外，种植施肥后土壤的有效磷、有效钾含量显著增加，可能与栽种烤烟到收获的过程中长期大量施用磷、钾肥料密切相关。

土壤酶参与土壤生物化学反应，是土壤微生物活性的重要指标之一（闫瑞瑞等，2017）。陈欢等（2014）研究表明，在砂姜黑土上采用化肥配施有机肥措施，可提高土壤的脲酶、磷酸酶、转化酶和过氧化氢酶活性。邓兆权等（2018）研究表明，微生物菌肥和水溶性肥料配施可改善植烟土壤的理化性质，同时提高土壤的脲酶和蔗糖酶活性。过氧化氢酶可分解有害毒物，蔗糖酶与土壤有机质降解密切相关，脲酶和磷酸酶参与氮磷转化（隋宗明等，2017）。本研究中，土壤酶活性因种植施肥模式的不同而存在差异，过氧化氢酶、蔗糖酶、脲酶和磷酸酶活性总体上以R-CFM处理较高，说明在轮作和施用有机肥的土壤中，微生物活性较强，有益于改善有机质循环，促进氮磷转化，提高养分生物有效性。

在轮作和施用有机肥处理中，多种作物残体和有机质进入土壤，可满足土壤微生物对能源、碳源、氮源和养分等多方面的需要，有益于微生物的生长繁殖，增加其数量，与陈义等（2010）在设施菜地和普通农地上的研究结果相似。此外，在不同种植施肥处理的土壤中，细菌群落明显不同。按照C-CF、C-CFM、R-CF和R-CFM处理的顺序，细菌群落的Chao1、Heip和Shannon指数逐渐增加，说明细菌种群增多，密度增大。多样性指数指示生物群落中物种的多寡和密度，是生态环境量的表征（陈芙蓉等，2013）。土壤微生物量轮作高于连作，有机肥化肥配施高于单施化肥，说明轮作和施用有机肥可提高细菌群落多样性指数，意味着土壤生态环境改善，土壤生物多样性增加。但土壤中大量细菌的生物学特性和功能尚不清楚，今后有必要继续开展相关研究。

微生物种群不同，其生理、生化及生态功能也存在差异（刘艳霞等，2017）。本研究通过高通量测序技术对具体细菌门、属进行深入分析，发现相对丰度≥8.47%的细菌包括变形菌门、放线菌门、绿弯菌门和酸杆菌门等4个门类，相对丰度合计为79.76%～80.97%，其相对丰度因种植模式而异。Venn分析结果进一步表明，虽然经过多年种植施肥，不同处理土壤中的细菌种群仍具有较高的相似性，但轮作和有机肥化肥配施能提高细菌的多样性。在前16种优势细菌中，有6种（属）共同存在于各处理土壤中。其中，厌氧绳菌属、玫瑰弯菌属、酸杆菌亚群-6和鞘脂单胞菌为绝对优势菌属（种），种植和施肥影响其丰富度，说明土壤是决定细菌组成的基本要素，但因种植施肥而发生不同程度的变化。酸杆菌和放线菌是自然界分布最广泛的微生物类群之一（Wise et al.，1997;Barns et al.，1999）;厌氧绳菌属是绿弯菌门的代表菌群类，是厌氧降解有机物主要微生物之一（陆海飞等，2015）;酸杆菌属参与土壤有机质循环，故酸杆菌亚群-6可能对供试土壤的有机质降解和腐殖质合成有重要作用;玫瑰弯菌属为绿弯菌门类，未见有关其生理、生化系生态功能的报道。在轮作的土壤中，3种绝对优势菌属的相对丰度增加，有利于有机质循环，提高土壤养分的生物有效性。此外，硝化螺旋菌属为各处理土壤的共有优势细菌，参与土壤硝化反应。旱生植物尤其是烤烟喜好硝态氮，需要适宜的硝化反应。但C-CF处理的土壤硝化螺旋菌属高出轮作近1倍，推测连作土壤的硝化强度剧烈，易发生氮素损失，降低氮肥利用率。

4 结论

采用轮作和有机肥化肥配施的种植施肥模式，土壤pH稳定，有机质、微生物生物量、土壤酶活性及细菌多样性指数等较高，有益于作物高产优质，并保持土壤健康质量，是一种用养结合的种植施肥模式，值得在黔北烟区推广应用。

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（责任编辑 王 晖）