中华绒螯蟹致病性弗氏柠檬酸杆菌的分离鉴定及其药敏特性

黄晓东 周慧华 安健 杨先乐 曹海鹏

摘要：【目的】明确中华绒螯蟹黑鳃病的病原菌及其药敏特性，为该病的临床诊断和防控提供科学依据。【方法】采用传统方法从患黑鳃病的中华绒螯蟹肝胰腺组织中分离病原菌，通过人工回归感染试验确定病原菌的致病性，利用API 20E细菌鉴定系统和16S rRNA序列分析对病原菌进行鉴定，并以K-B药敏纸片扩散法测定其药敏特性。【结果】从患黑鳃病的中华绒螯蟹肝胰腺中共分离获得4株疑似病原菌株（C1、C2、C3和C4），人工回归感染试验结果表明，仅C1菌株感染中华绒螯蟹后出现死亡，死亡率达90%，且试验中华绒螯蟹出现黑鳃、肝胰腺呈浅黄色的病症，与自然发病的症状基本一致。依据C1菌株的生理生化特性及16S rRNA序列分析结果，可确定C1菌株为弗氏柠檬酸杆菌（Citrobacter freundii），其对健康中华绒螯蟹的半数致死剂量（LD50）为2.85×105 CFU/mL。药敏试验结果表明，C1菌株对新霉素、阿米卡星、庆大霉素、链霉素、多西环素、四环素、复方新诺明、氧氟沙星和恩诺沙星等9种抗生素高度敏感，对多粘菌素B中度敏感，对氨苄西林、羧苄青霉素和万古霉素3种抗生素已产生耐药性（不敏感）。【结论】弗氏柠檬酸杆菌感染可引起中华绒螯蟹黑鳃病，且对中华绒螯蟹具有较强毒力，实际养殖生产中可选用新霉素、多西环素等渔用抗生素进行防治。

关键词： 中华绒螯蟹;黑鳃病;弗氏柠檬酸杆菌;分离鉴定;药敏特性

0 引言

【研究意义】中华绒螯蟹（Eriocheir sinensis）俗称河蟹、大闸蟹，广泛分布在我国沿海和湖泊地区，是江苏、安徽、湖北、浙江和辽宁等地区的重要特种水产养殖品种（付龙龙等，2017）。近年来，随着中华绒螯蟹市场需求量的不断增加，其养殖业迅猛发展，年产量已超过81万t（农业部渔业渔政管理局，2017）。但随着中华绒螯蟹养殖密度及规模的不断扩大，加上杀虫剂和除藻剂的大量使用，导致其养殖环境恶化，各种病害频发，尤其是弗氏柠檬酸杆菌（Citrobacter freundii）引起的细菌性病害给中华绒螯蟹养殖造成巨大经济损失（唐玉华和胡宾，2015）。因此，加快中华绒螯蟹源弗氏柠檬酸杆菌的鉴定及药敏特性检测，对确保中华绒螯蟹养殖业的持续健康发展具有重要意义。【前人研究进展】弗氏柠檬酸杆菌隶属于肠杆菌科（Enterobacteriaceae）柠檬酸杆菌属（Citrobacter），可引起多种水产动物感染发病，严重制约水产业的健康发展，如红螯螯虾（Cherax quadricarinatus）暴发性死亡（沈锦玉等，2005）、施氏鲟（Acipenser schrenckii）肿嘴病（杨移斌等，2013）、中华鳖（Pelodiscus sinensis）腮腺炎（毛烁君等，2015）、中华绒螯蟹败血症（姜光明等，2016）、棘腹蛙（Paa boulengeri）水肿病（李晓英等，2016）、克氏原螯虾（Procambarus clarkii）暴发性死亡（肖宁等，2016）和罗氏沼虾（Macrobrachium rosenbergii）黑鳃病（冯艺等，2017）等均由弗氏柠檬酸杆菌引起。弗氏柠檬酸杆菌具有鞭毛和菌毛，二者均为细菌的黏附素，有助于细菌侵入机体后黏附于细胞表面，经定居、繁殖及释放大量内毒素而引起宿主发病甚至死亡（郭志燕等，2014）。关于弗氏柠檬酸杆菌引起中华绒螯蟹发病的研究已有报道，在辽宁（盘锦）、河北等地养殖的中华绒螯蟹曾先后暴发过弗氏柠檬酸杆菌病，但对比发现这些地区发生的中华绒螯蟹弗氏柠檬酸杆菌病症状完全不同，有的患病中华绒螯蟹表现为肝胰腺、鳃和肌肉轻度水肿，且部分肝胰腺和鳃组织呈腐烂状（李华等，2001）;有的患病中华绒螯蟹则腹腔内有积水，其鳃组织呈暗灰色、肝胰腺呈浅黄色（陈翠珍等，2006）。因此，有必要明确弗氏柠檬酸杆菌引起中华绒螯蟹发病但表现出不同临床症状的致病机理，并制定出科学的用药方案及防控措施。【本研究切入点】2017年8月，江苏省某养殖场的中华绒螯蟹出现严重黑鳃病，具体症状表现为病蟹行动迟缓，摄食减少或不摄食，鳃呈黑色，肝胰腺呈浅黄色，与已报道的中华绒螯蟹弗氏柠檬酸杆菌病症状（李华等，2001;陈翠珍等，2006;姜光明等，2016）有所不同，因此急需鑒定其病原并科学用药以减少经济损失。【拟解决的关键问题】通过对中华绒螯蟹黑鳃病进行病原菌分离鉴定，并采用K-B药敏纸片扩散法测定其药敏特性，以期为该病的临床诊断和防控提供科学依据。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

具有典型黑鳃病症状的中华绒螯蟹由江苏省某养殖场提供，平均体重49.8 g/只，共16只;健康中华绒螯蟹由上海崇明某养殖场提供，平均体重28.3 g/只，共150只。药敏纸片购自杭州滨河微生物试剂有限公司;营养琼脂培养基和无菌生理盐水由国家水生动物病原库（上海海洋大学）自制。

1. 2 病原菌分离

选取具有典型发病症状的濒死中华绒螯蟹，病蟹以75%酒精表面消毒后无菌采取其肝胰腺组织，再用无菌接种环取样在营养琼脂培养基上进行划线接种，30 ℃恒温培养18～24 h，待菌落长出后进行菌株纯化，最后将纯化菌株转接至营养琼脂斜面培养基上，30 ℃恒温培养24～48 h后观察菌落形态特征及革兰氏染色镜检，或4 ℃保存备用。

1. 3 人工回归感染试验

选取无病伤、体质健壮、规格均匀的健康中华绒螯蟹进行人工回归感染试验。试验设4个试验组和1个对照组，每组10只中华绒螯蟹。试验前用无菌生理盐水分别洗下营养琼脂斜面培养基上的菌落，采用稀释涂布平板法测定并以无菌生理盐水调节菌悬液浓度至5.0×106 CFU/mL。试验组中华绒螯蟹分别在第三步足基部注射0.1 mL菌悬液（徐海圣等，2002），对照组注射等量无菌生理盐水。养殖水温28 ℃，试验周期7 d，期间每天记录试验中华绒螯蟹的死亡数量，观察其病症，及时捞出死蟹并再次进行病原菌分离，确定其致病性。

1. 4 病原菌鉴定

参照Underwood和Avsion（2004）的方法采用API 20E细菌鉴定系统对病原菌株进行生理生化鉴定，然后参照冯艺等（2017）的方法以16S rRNA序列分析对其进行分子鉴定。分离菌株的16S rRNA序列委托生工生物工程（上海）股份有限公司完成测序，测序结果与GenBank中的已知序列进行同源性比对分析，并通过邻接法（Neighbour-Joining）构建系统发育进化树（肖艳翼等，2015）。

1. 5 病原菌毒力测定

试验设4个试验组和1个对照组，每组10只中华绒螯蟹。试验前用无菌生理盐水将分离菌株制备成2.0×104～2.0×107 CFU/mL的菌悬液，试验组中华绒螯蟹分别在第三步足基部注射0.1 mL菌悬液（徐海圣等，2002），对照组注射等量无菌生理盐水。试验周期7 d，期间每天记录试验中华绒螯蟹的死亡数量，及时捞出死蟹进行病原菌分离鉴定，并根据概率单位图解法测定分离菌株对中华绒螯蟹的半数致死剂量（LD50）。

1. 6 病原菌药敏特性测定

参照陈永亮等（2015）的K-B药敏纸片扩散法测定分离菌株的药敏特性，并根据杭州滨河微生物试剂有限公司的《纸片法药敏试验抑菌圈直径判断标准》判定其对各种抗生素的敏感度。

2 结果与分析

2. 1 病原菌分离结果

从患黑鳃病的中华绒螯蟹肝胰腺中共分离获得4株疑似病原菌株，暂命名为C1、C2、C3和C4。人工回归感染试验结果（表1）表明，仅C1菌株感染中华绒螯蟹后出现死亡，死亡率达90%，且试验中华绒螯蟹出现黑鳃、肝胰腺呈浅黄色的病症（图1），与自然发病的症状基本一致;从人工感染的发病中华绒螯蟹肝胰腺中可再次分离获得与C1菌株生理生化特性一致的菌株，因此判定C1菌株是引起中华绒螯蟹黑鳃病的病原菌。C1菌株在营养琼脂培养基上生长形成的菌落呈圆形，灰白色，表面光滑湿润、半透明;革兰氏染色呈阴性，菌体短杆状（图2）。

2. 2 病原菌鉴定结果

采用API 20E细菌鉴定系统对C1菌株进行生理生化鉴定，结果（表2）表明，C1菌株为弗氏柠檬酸杆菌（C. freundii），其鉴定结果的可信度为99.3%;与弗氏柠檬酸杆菌参考菌株（杨移斌等，2013）的生理生化特性一致，且C1菌株16S rRNA序列（GenBank登录号MK069596）与GenBank中已有弗氏柠檬酸杆菌参考菌株16S rRNA序列的同源性达99%（表3）。由基于16S rRNA序列同源性构建的系统发育进化树（图3）也可看出，C1菌株与弗氏柠檬酸杆菌I-T-1-3株（GenBank登录号KU570303）的亲缘关系最近。因此，依据C1菌株的生理生化特性及16S rRNA序列分析结果，可确定C1菌株为弗氏柠檬酸杆菌。

2. 3 病原菌毒力检测结果

以不同浓度（2.0×104～2.0×107 CFU/mL）的菌悬液分别对健康中华绒螯蟹进行注射感染，导致中华绒螯蟹的死亡率达20%～100%（表4）;而注射无菌生理盐水的中华绒螯蟹未出现任何病症及死亡现象，说明试验中华绒螯蟹的死亡为C1菌株感染所致。根据概率单位图解法建立的死亡概率（y）与悬液菌浓度对数（x）关系曲线方程为y=0.683x+1.274（R2=0.9823），即C1菌株对健康中华绒螯蟹的LD50为2.85×105 CFU/mL。

2. 4 病原菌的藥敏特性

由表5可知，C1菌株对新霉素、阿米卡星、庆大霉素、链霉素、多西环素、四环素、复方新诺明、氧氟沙星和恩诺沙星等9种抗生素高度敏感，对多粘菌素B中度敏感，对氨苄西林、羧苄青霉素和万古霉素3种抗生素已产生耐药性（不敏感）。

3 讨论

黑鳃病是中华绒螯蟹常见的细菌性疾病之一，其病原菌有气单胞菌（曹海鹏，2015）、产吲哚黄金杆菌（郑世雄，2013）等，但关于弗氏柠檬酸杆菌引起中华绒螯蟹黑鳃病的研究鲜见报道。弗氏柠檬酸杆菌是一种人—畜—水生动物共患致病菌（薛巧等，2015），能产生多种毒力因子，不仅具有蛋白酶活性、溶血活性和形成生物膜的能力，还有鞭毛和菌毛等黏附素，有助于侵入机体后黏附于细胞表面形成生物膜，通过定居、繁殖及释放大量毒素引起溶血和细胞坏死，进而导致机体损伤（郭志燕等，2014;Heo et al.，2017），说明弗氏柠檬酸杆菌对水产动物的致病力与这些毒力因子密切相关。陈红莲等（2014）研究表明克氏原螯虾源弗氏柠檬酸杆菌X120523株的LD50为3.16×107 CFU/mL，冯艺等（2017）研究发现罗氏沼虾源弗氏柠檬酸杆菌CF9527株的LD50为1.68×106 CFU/mL。本研究从患黑鳃病的中华绒螯蟹肝胰腺中分离获得1株弗氏柠檬酸杆菌（C1菌株），人工感染健康中华绒螯蟹后表现出黑鳃、肝胰腺呈浅黄色的病症，与自然发病的症状基本一致，对应的LD50为2.85×105 CFU/mL，其毒力高于弗氏柠檬酸杆菌X120523株（陈红莲等，2014）和CF9527株（冯艺等，2017），可能与弗氏柠檬酸杆菌不同菌株携带的毒力因子种类和数量不同有关。此外，养殖环境突变可促使中华绒螯蟹产生应激反应，消耗大量能量而降低抵抗力（李华等，2001）。因此，弗氏柠檬酸杆菌对中华绒螯蟹的致病性与养殖环境恶化也有一定关系。

弗氏柠檬酸杆菌不同菌株通常也存在理化特性差异。李华等（2001）分离获得的中华绒螯蟹源弗氏柠檬酸杆菌9773株与陈翠珍等（2006）分离获得的中华绒螯蟹源弗氏柠檬酸杆菌HQ010516B-1株在肌醇发酵特性方面存在明显差异。因此，弗氏柠檬酸杆菌的鉴定需要以生理生化鉴定结合16S rRNA序列分析为依据。本研究依据C1菌株的生理生化特征及16S rRNA序列分析结果，最终判定C1菌株为弗氏柠檬酸杆菌，即弗氏柠檬酸杆菌可感染引起中华绒螯蟹黑鳃病，且对中华绒螯蟹具有较强毒力。此外，本研究发现C1菌株与李华等（2001）分离获得的中华绒螯蟹源弗氏柠檬酸杆菌9773株在柠檬酸盐利用、肌醇发酵等生化特性方面存在差异，与陈翠珍等（2006）分离获得的中华绒螯蟹源弗氏柠檬酸杆菌HQ010516B-1株在β-半乳糖苷酶、脲酶等生化特性方面存在差异，可能与地区、气候和水质条件等因素有关（李小波和黄文芳，2003），但具体原因有待进一步探究。

近年来，虽然基于中药、益生菌等新型抗生素替代品的疾病防控技术研究取得显著进展，但由于这些抗生素替代品尚存在应用效果不稳定、成本较高、基础理论研究不完善等问题（王熙涛等，2015），因此，合理使用和选择有效抗生素仍是防控细菌性疾病的主要手段。本研究的药敏试验结果表明，C1菌株对多西环素、新霉素和恩诺沙星等渔用抗生素高度敏感，可作为防治中华绒螯蟹黑鳃病的首选药物;但C1菌株对四环素类抗生素的敏感性与中华绒螯蟹源弗氏柠檬酸杆菌9773株（李华等，2001）和HQ010516B-1株（陈翠珍等，2006）存在差异，说明中华绒螯蟹源弗氏柠檬酸杆菌不同菌株间也存在药敏特性差异。因此，临床用药时必须依据药敏试验结果有针对性地选择最有效的药物进行治疗，以减轻病原菌的耐药性和提高病害防控效果。C1菌株对氨苄西林和羧苄青霉素等青霉素类抗生素已产生耐药性，与陈翠珍等（2006）、Heo等（2017）对弗氏柠檬酸杆菌耐药性的研究结果相同，可能与弗氏柠檬酸杆菌普遍携带β-内酰胺酶耐药基因有关（吴荣辉等，2013）。

4 结论

弗氏柠檬酸杆菌感染可引起中华绒螯蟹黑鳃病，且对中华绒螯蟹具有较强毒力，实际养殖生产中可选用新霉素、多西环素等渔用抗生素进行防治。

参考文献：

曹海鹏. 2015. 河蟹黑鳃病的诊治实例[J]. 海洋与渔业，（9）：82-83. [Cao H P. 2015. Diagnosis and treatment of black gill disease of Eriocheir sinensis[J]. Ocean and Fishery，（9）：82-83.]

陈翠珍，张晓君，房海，巩元芳，葛慕湘. 2006. 中华绒螯蟹病原弗氏柠檬酸杆菌的鉴定[J]. 中国人兽共患病杂志，22（2）：136-141. [Chen C Z，Zhang X J，Fang H，Gong Y F，Ge M X. 2006. Identification of Citrobacter freundii isolated from crab（Eriocheir sinensis）[J]. Chinese Journal of Zoonoses，22（2）：136-141.]

陈红莲，宋光同，何吉祥，侯冠军，王永杰. 2014. 克氏原螯虾弗氏柠檬酸杆菌的分离鉴定与药敏试验[J]. 淡水渔业，44（1）：73-77. [Chen H L，Song G T，He J X，Hou G J，Wang Y J. 2014. Isolation，identification and antibiotics susceptibility test of Citrobacter freundii from Procambarus clarkii[J]. Freshwater Fisheries，44（1）：73-77.]

陈永亮，高晓华，李怡，郭珺，魏保岭，杨先乐. 2015. 鳖源摩氏摩根菌分离鉴定及药敏特性分析[J]. 南方农业学报，46（11）：2046-2052. [Chen Y L，Gao X H，Li Y，Guo J，Wei B L，Yang X L. 2015. Isolation，identification and antibio-tic sensitivity test of Morganella morganii from Trionyx sciensis[J]. Journal of Southern Agriculture，46（11）：2046-2052.]

馮艺，杨树浩，杨映，吴勇亮，陈建酬. 2017. 罗氏沼虾费氏柠檬酸杆菌的分离鉴定及药敏分析[J]. 中国兽医科学，47（11）：1411-1417. [Feng Y，Yang S H，Yang Y，Wu Y L，Chen J C. 2017. Isolation and identification of Citrobacter freundii from diseased giant freshwater prawn（Macrobrachium rosenbergii）[J]. Chinese Veterinary Science，47（11）：1411-1417.]

付龙龙，周刚，李跃华，陆全平，潘建林. 2017. 中华绒螯蟹蟹种性早熟研究进展[J]. 江苏农业科学，45（12）：19-23. [Fu L L，Zhou G，Li Y H，Lu Q P，Pan J L. 2017. Research advances of sexual precocity in Eriocheir sinensis[J]. Jiangsu Agricultural Sciences，45（12）：19-23.]

郭志燕，周明旭，段强德，朱国强. 2014. 细菌鞭毛的致病性及其免疫学应用的研究进展[J]. 微生物学报，54（3）：251-260. [Guo Z Y，Zhou M X，Duan Q D，Zhu G Q. 2014. Advance on the pathogenicity and immunological application of bacterial flagella—A review[J]. Acta Microbiolo-gica Sinica，54（3）：251-260.]

姜光明，钱彩源，顾雪林，魏宾，徐乐，宋学宏. 2016. 中华绒螯蟹和克氏原螯虾细菌性败血症病原学研究[J]. 水产养殖，37（4）：46-51. [Jiang G M，Qian C Y，Gu X L，Wei B，Xu L，Song X H. 2016. The etiological agents of bacterial septicemia in Eriocheir sinensis and Procambarus clarkii[J]. Journal of Aquaculture，37（4）：46-51.]

李華，邢殿楼，白国福，李向晖. 2001. 弗氏柠檬酸杆菌对河蟹致病性的研究[J]. 水生生物学报，25（3）：217-223. [Li H，Xing D L，Bai G F，Li X H. 2001. Studies on disease of mitten crab caused by Citrobacter freudii[J]. Acta Hydrobiologica Sinica，25（3）：217-223.]

李小波，黄文芳. 2003. 丰产鲫细菌性败血病的研究I——病原分离与鉴定[J]. 微生物学通报，30（5）：56-61. [Li X B，Huang W F. 2003. Study on the bacterial septicemia of Carassius Auratus of penze（♀）×Cyprinus acutidorsalis（♂） I—Isolation and identification of the pathogen[J]. Microbiology Bulletin，30（5）：56-61.]

李晓英，罗洁，杜孝田，龙方伟，胡凯，徐敬明，樊汶樵. 2016. 棘腹蛙“水肿病”病原的分离鉴定[J]. 动物医学进展，37（8）：116-119. [Li X Y，Luo J，Du X T，Long F W，Hu K，Xu J M，Fan W Q. 2016. Isolation and identification of pathogenic bacteria caused “edema disease” in Paa boulengeri[J]. Progess in Veterinary Medicine，37（8）：116-119.]

毛烁君，斯广杰，任晓金，石婷婷，章烨，王卓瑞，章晓栋. 2015. 一株多重耐药中华鳖源弗氏柠檬酸杆菌的分离鉴定[J]. 淡水渔业，45（2）：102-106. [Mao S J，Si G J，Ren X J，Shi T T，Zhang Y，Wang Z R，Zhang X D. 2015. Isolation and identification of multidrug resistant Citrobacter freundii from diseased soft-shelled turtle，Pelodiscus sinenis[J]. Freshwater Fisheries，45（2）：102-106.]

农业部渔业渔政管理局. 2017. 中国渔业统计年鉴[M]. 北京：中国农业出版社. [Fisheries and Fisheries Administration Bureau of the Ministry of Agriculture. 2017. Statistical yearbook of fisheries of China[M]. Beijing：China Agriculture Press.]

沈锦玉，顾志敏，潘晓艺，周保中，尹文林，曹铮. 2005. 红螯螯虾弗氏柠檬酸杆菌病病原的分离与鉴定[J]. 中国水产科学，12（2）：197-200. [Shen J Y，Gu Z M，Pan X Y，Zhou B Z，Yin W L，Cao Z. 2005. Isolation and identification of Citrobacter freundii from Cherax quadricarinatus[J]. Journal of Fishery Sciences of China，12（2）：197-200.]

唐玉华，胡宾. 2015. 河蟹常见疾病的主要症状与治疗方法[J]. 海洋与渔业，（6）：44-45. [Tang Y H， Hu B. 2015. The main symptoms and treatment of common diseases of Eriocheir sinensis[J]. Ocean and Fishery，（6）：44-45.]

王熙涛，卢燕丹，王丽丽，李晓宇，李淑英，车鉴，徐永平. 2015. 新型抗生素替代品防治水产动物细菌性疾病的研究进展[J]. 饲料与畜牧，（4）：18-22. [Wang X T，Lu Y D，Wang L L，Li X Y，Li S Y，Che J，Xu Y P. 2015. Research progress on new antibiotics substitutes in the prevention and treatment of bacterial diseases in aquatic animals[J]. Feed and Animal Husbandry，（4）：18-22.]

吴荣辉，何建新，金小珍. 2013. 弗氏柠檬酸杆菌β-内酰胺酶检测及耐药性分析[J]. 中华医院感染学杂志，23（24）：6112-6114. [Wu R H，He J X，Jin X Z. 2013. Detection of β-lactamases produced by Citrobacter freundii and analysis of drug resistance[J]. Chinese Journal of Nosocomio-logy，23（24）：6112-6114.]

肖宁，孔令严，周昊，曹际，李槿年，相翊卿，王蒙蒙. 2016. 克氏原螯虾病原弗氏柠檬酸杆菌的分离鉴定及其药敏与黏附特性[J]. 水产学报，40（6）：946-955. [Xiao N，Kong L Y，Zhou H，Cao J，Li J N，Xiang Y Q，Wang M M. 2016. Isolation and identification od Citrobacter freundii from diseased Procambarus clarkii and its antibiotics susceptibility and adhesion characteristics[J]. Journal of Fi-shery Sciences of China，40（6）：946-955.]

肖艳翼，王斌，夏永涛，胡利静，胡鲲，杨先乐. 2015. 鲟病原性温和气单胞菌的分离鉴定及药敏试验[J]. 南方农业学报，46（10）：1909-1914. [Xiao Y Y，Wang B，Xia Y T，Hu L J，Hu K，Yang X L. 2015. Isolation，identification and drug sensitivity test of pathogenic Aeromonas sobria from sturgeon[J]. Journal of Southern Agriculture，46（10）：1909-1914.]

徐海圣，舒妙安，占秀安，王淑霞. 2002. 养殖河蟹弧菌病病原菌分离鉴定及其胞外产物的致病性[J]. 水产学报，26（4）：357-362. [Xu H S，Shu M A，Zhan X A，Wang S X. 2002. Identification of Vibrio parahemolyticus isolated from cultured Eriocheir sinensis and pathogenicity of its extracellular products[J]. Journal of Fisheries of China，26（4）：357-362.]

薛巧，赵战勤，刘会胜，薛云，董发明. 2015. 弗氏柠檬酸杆菌对动物和人致病性研究进展[J]. 动物医学进展，36（7）：81-85. [Xue Q，Zhao Z Q，Liu H S，Xue Y，Dong F M. 2015. Progress on Citrobacter freundii pathogenicity in animals and humans[J]. Progress in Veterinary Medicine，36（7）：81-85.]

杨移斌，夏永涛，赵蕾，郑卫东，邱军强，曹海鹏，胡鲲，杨先乐. 2013. 鲟源弗氏柠檬酸杆菌杆菌分离鉴定及药敏特性研究[J]. 水生生物学报，37（4）：766-771. [Yang Y B，Xia Y T，Zhao L，Zheng W D，Qiu J Q，Cao H P，Hu K，Yang X L. 2013. Isolation and idrntification of Citrobacter freundii from amur sturgeon（Acipenser schrenckii Brandt） and its antibiotic sensitivity[J]. Acta Hydrobiologica Sinica，37（4）：766-711.]

郑世雄. 2013. 池塘养殖中华绒螯蟹细菌性疾病的病原鉴定及流行病学调查[D]. 合肥：安徽农业大学. [Zheng S X. 2013. Identification of pathogens and epidemiological surver of bacteriosis of farmed Eriocheir sinensis in ponsd[D]. Hefei：Anhui Agricultural University.]

Heo G J， Hossain S，Wimalasena S H M P. 2017. Virulence factors and antimicrobial resistance pattern of Citrobacter freundii isolated from healthy pet turtles and their environment[J]. Asian Journal of Animal and Veterinary Advances，12（1）：10-16.

Underwood S，Avsion M B. 2004. Citrobacter koseri and Citrobacter amalonaticus isolates carry highly divergent β-lactamase genes despite having high levels of bioche-mical similarity and 16S rRNA sequence homology[J]. Journal of Antimicrobial Chemotherapy，53（6）：1076-1080.

（責任编辑 兰宗宝）