miRNA-429与SIAH1在结直肠癌发生发展中的作用的研究进展

张 威，马志斌，羊轶驹

(1. 哈尔滨医科大学附属第一医院消化内科，黑龙江哈尔滨 150000；2. 海南省儋州市人民医院，海南儋州 571700)

结直肠癌是消化系统最常见的恶性肿瘤之一。Global Cancer Statistics 2018统计数据显示，2018年，全球结直肠癌新发病例超过1 800 000，且死亡患者数881 000例，约占据全球恶性肿瘤的1/10[1]。结直肠癌发病率位居全球第3位，死亡率位居全球第2位。在地域分布上，结直肠癌主要分布于高人类发展指数地区，如北美和西欧。但近年来，受饮食模式改变、肥胖人口增加、生活方式改变及经济发展等影响，结直肠癌分布上显示出在发展中国家发病率显著提高的这一新趋势[2-3]。目前，结直肠癌的主要临床治疗手段为手术治疗辅以放化疗，但半数以上患者容易复发及转移。因而，阐明结直肠癌的发病机制、寻找其生物学标记物对于结直肠癌的诊治、降低其病死率尤为重要。现有研究证实，结直肠癌的发生发展与miRNA相关联[4]。

2002年，CALIN等[5]指出，miRNA-15与miRNA-16在慢性淋巴细胞白血病细胞中表达缺失，从此对miRNA在肿瘤中作用的研究不断深入。miRNA作为一类细胞内源性非编码类小RNA，基于碱基互补配对原则与目标mRNA配对，导致mRNA失去稳定性、降解、翻译抑制，甚至直接清除，由此miRNA调节原癌基因与抑癌基因的表达，影响肿瘤的发生及进展。现有研究证实，miRNA-429参与结直肠癌发生及进展过程，也有研究提示，其与在肿瘤发展过程中扮演重要角色的SIAH1存在靶向关系。本文主要对miRNA-429及作用靶点SIAH1在结直肠癌中的作用进行总结概括。

1 miRNA-429的结构与功能

miRNA-429是一类非编码类内源性单链小RNAs，其长度为20～25个核苷酸，编码基因位于1号染色体。miRNA-429的种子序列为AAUACUG，决定了miRNA与目标mRNA的结合位点。miRNA-429作为一类RNAs，通过下述一系列步骤生成并发挥作用：首先，在细胞核内，miRNAs编码基因在RNA多聚酶Ⅱ作用下转录生成primary miRNAs(pri-miRNAs)；其次，pri-miRNAs在细胞核内由Dorsha及DGCR8等核心组成的微处理器复合物加工，生成precursor miRNAs(pre-miRNAs)；再次，pre-miRNAs以膜输出蛋白-5为载体转运至细胞质；最后，核糖核酸酶DICER剪切pre-miRNAs。至此，miRNAs形成[6]。在细胞质中，向导股miRNAs载入核心Argonaute proteins(AGO)蛋白及附属蛋白构成miRNA induced silencing complex(miRISC)。MiRISC基于序列互补配对原则与目标mRNA3′端非翻译区配对结合。一旦配对结合，miRNA便通过抑制目标基因翻译环节抑制相应蛋白生成,同时这一过程伴随着mRNA脱腺苷化及mRNA的减少。通过上述调节机制，miRNA在多种细胞进程中发挥重要作用，如细胞增生、细胞周期调控、细胞凋亡、细胞分化及细胞侵袭，以及组织特异功能如免疫反应、激素释放、血管生成等。

2 miRNA-429在结直肠癌中作用的研究

2.1 miRNA-429在结直肠癌发生过程中的作用癌的发生是正常细胞转变为恶性肿瘤细胞的过程。不同于正常细胞，癌细胞具有两大特性，即生长增殖不受控制，侵犯邻近正常组织并转移至远处器官组织[7]。MO等[4]通过分析转染miRNA-429与转染anti-miRNA-429两组结直肠癌细胞系Caco2细胞的凋亡，结果显示，转染miRNA-429的结直肠癌细胞凋亡增加，而转染anti-miRNA-429的结直肠癌细胞凋亡减少，这提示miRNA-429促进结直肠癌细胞的凋亡。同时，MO等[4]通过分析转染miRNA-429组或转染anti-miRNA-429组结直肠癌细胞系Caco2细胞生存力，结果提示，相比于转染anti-miRNA-429组，转染miRNA-429组结直肠癌细胞生存力稳定下降。此外，高表达的miRNA-429使结直肠癌细胞系SW480细胞聚集于细胞周期G1期，这提示miRNA-429表达阻滞了细胞的细胞周期进展。最后，MO等[4]发现，miRNA-429通过调节CHMP5介导的凋亡信号通路，实现对细胞增生、凋亡及细胞周期进展等过程调节。SUN等[8]通过实时荧光定量PCR测定结直肠癌组织细胞miRNA-429的表达，结果显示，相比邻近正常组织，Ⅱ期及Ⅲ期结直肠癌组织细胞内的miRNA-429表达下调；同时增强结直肠癌细胞系(SW620,SW480和HT-29)内miRNA-429的表达，抑制结直肠癌细胞的增生。SW620结直肠癌细胞系构建的裸鼠异种移植物动物模型证实，miRNA-429可以抑制体内结直肠癌肿瘤的生长。SUN等[8]提出miRNA-429通过靶向调节转录因子Onecut2影响结直肠癌发生。因此，miRNA-429抑制结直肠癌的发生，可以作为抑制结直肠癌发生的有力因子。

2.2 miRNA-429在结直肠癌转移过程中的作用

2.2.1miRNA-429在结直肠癌细胞迁移及浸润过程中的作用 肿瘤转移是肿瘤细胞由初始部位迁移至远处器官并形成转移瘤[9-10]。SUN等[8]通过细胞划痕实验检测miRNA-429对结直肠癌细胞活动性的影响，结果显示，增强miRNA-429表达下调了结直肠癌细胞的迁移能力；同样，通过细胞侵袭实验检测miRNA-429对结直肠癌细胞浸润能力的影响，结果显示，超表达miRNA-429抑制结直肠癌细胞的浸润能力。SiRNA干扰实验进一步证实miRNA-429通过靶向调节转录因子Onecut2抑制结直肠癌细胞的迁移及浸润。TIAN等[11]上调结直肠癌细胞miRNA-429表达，结果显示，超表达miRNA-429抑制结直肠癌细胞迁移及浸润能力。随后，TIAN等[11]发现，miRNA-429是通过负向调节PAK6/cofilin信号通路抑制结直肠癌细胞的迁移及入侵。

2.2.2miRNA-429在上皮-间质转移中的作用 上皮-间质转移，即正常具有极性的上皮细胞转变成间质细胞，其主要标志为细胞极性缺失、细胞间粘附缺失、强化迁移能力等。经过上皮-间质转移，细胞获得间质细胞特性并具有强化的迁移及浸润能力。上皮-间质转移的两个主要的特性即上皮标记物如E-钙黏素/细胞连接蛋白的缺失，间质标记物如N-钙黏素/α-平滑肌肌动蛋白/ZEB1及ZEB2等的增加。SUN等[8]研究发现，miRNA-429通过调控Onecut2、Onecut2介导的上皮-间质转移相关基因及转录激活物抑制结直肠癌细胞上皮-间质转移的发生。通过上述机制，miRNA-429抑制结直肠癌细胞的上皮-间质转移，继而抑制了结直肠癌的转移。

2.3 miRNA-429在结直肠癌中的作用现阶段就miRNA-429对结直肠癌的作用尚存在争议。少数研究报道，miRNA-429促进结直肠癌的发生及进展。2013年，LI等[12]通过检测107对结直肠癌组织与相邻正常组织的miRNA-429，结果提示，结直肠癌细胞内的miRNA-429表达上调，且同组实验验证超表达miRNA-429通过负向调控SOX2表达抑制结直肠癌细胞的凋亡。2017年，HAN等[13]检测71对结直肠癌组织与邻近正常组织的miRNA-429，结果显示，结直肠癌组织细胞内miRNA-429表达上调,并证实miRNA-429抑制HOXA5表达并促进结直肠癌进展及转移。同时，LI等[12]研究发现，高表达miRNA-429患者对比低表达患者预后不良；HAN等[13]研究发现，高表达miRNA-429患者平均生存时间缩短，且与结直肠癌淋巴结转移及肿瘤大小显著相关。实验使用的细胞系不同、结直肠癌肿瘤分期的差异以及实验组织样本的差异可能导致了与上述不同的结论，但仍倾向于miRNA-429抑制结直肠癌细胞的发生及发展。

3 SIAH1的结构、功能及在肿瘤中的作用

3.1 SIAH1的结构、功能SIAH1即E3泛素蛋白连接酶，其编码基因位于染色体16q12.1，在人类细胞内，SIAH1与SIAH2蛋白互为同源体，且两者在进化过程中间保持高度一致性。在结构上，SIAH1包含4个结构域：the really interesting new gene (RING) domain、the SIAH-type zinc finger (SZF) domain、the substrate-binding site (SBS)、the dimerization domain (DIMER)[14]。RING domain是E3连接酶的催化活性位点；基质结合域由SZF域、SBS域及DIMER域构成，负责基质识别、靶向作用、关联及降解退化[15]。SIAH1作为E3泛素连接酶，通过干扰、修饰基质，统筹泛素介导的蛋白降解，调节蛋白稳定性，负责蛋白复合物的组装和蛋白亚细胞内定位等[16]。

3.2 SIAH1在结直肠癌及相关肿瘤中的作用SANDRA等[17]通过分析干扰SIAH1蛋白对结直肠癌细胞增殖的影响，结果显示，SIAH1减少导致结直肠癌细胞内致癌因子β-catenin的升高，而超表达SIAH1导致细胞内β-catenin下降，提示SIAH1促进β-catenin的降解。而β-catenin已被证实促进多种原癌基因的表达，并被认为是促进结直肠癌发生及进展的重要因素[18-19]。在同一实验中敲除SIAH1基因可导致原癌基因c-MYC的增加[20]。这些提示SIAH1抑制结直肠癌的发生及进展。同样，在胃癌[21]、白血病[22]、乳腺癌[23]及神经胶质瘤[24]等肿瘤研究中，均提示SIAH1为抑癌因子。WONG等[25]对以往SIAH1在肿瘤中的作用作总结，也倾向于SIAH1为抑癌因子。但在肝癌这一肿瘤类型中，SIAH1被证实是原癌因子，起促进肿瘤的作用。BRAUCKHOFF等[26]检测正常肝脏组织、癌前病变肝组织及肝癌组织细胞内SIAH1蛋白并作对比，结果显示，对比于非肿瘤肝细胞，SIAH1在肝癌细胞核内显著蓄积。进一步运用特异siRNA干扰SIAH1基因表达并分析对肝癌细胞增生及迁移的影响，结果提示，肝癌细胞核SIAH1下调导致肝癌细胞的生存力及迁移能力下降；超表达的SIAH1引起肝癌细胞生存力中等程度地提高，提示SIAH1促进肝癌细胞的增生及转移。值得注意的是，通常在肝癌细胞SIAH1是下调的。我们认为，SIAH1在细胞内的表达是一个动态过程，且SIAH1在细胞内的亚定位影响其与基质结合，影响其在肿瘤中的作用。现阶段关于SIAH1在结直肠癌中的研究尚少，难以就其促进或抑制结直肠癌下结论，仍需不断探索。

4 MiRNA-429、SIAH1在肿瘤中的作用

现阶段，有很多关于miRNA靶向作用SIAH1并影响肿瘤进展的研究。JIANG等[27]证实，敲除miRNA-299-5p可以靶向作用SIAH1并抑制肝细胞癌的进展。ZHANG等[28]发现，miRNA-107可以靶向控制SIAH1并促进乳腺癌细胞的增生及进展。FLORES等[29]证明，miR-994靶向作用于SIAH1并抑制乳腺癌细胞的增生及转移。在结直肠癌这一肿瘤类型中，目前尚无miRNA-429与SIAH1在结直肠癌中作用的研究，但由马志斌副教授主持的课题组，通过生物信息学数据库Target scan，在线分析预测miR-429特异性靶基因，结果显示，miRNA-429可以靶向作用SIAH1的3′-UTR区。为证实这一假设，该课题组运用双荧光素酶实验检测miRNA-429对SIAH1的靶向调控，结果显示，SIAH1基因的3′-UTR区有miRNA-429的特异性结合位点，且后续细胞学实验证实，miRNA-429抑制SIAH1表达(图1)，同时，miRNA-429靶向调控SIAH1影响结直肠癌细胞增殖(相关研究结果正在发表中)。

图1 miR-429负性调控SIAH1蛋白的表达

Fig.1 miR-429 negatively regulated the expression of SIAH1

5 前景和展望

近年来，结直肠癌的发病率不断攀升，对人类的健康造成巨大威胁。现阶段，结直肠癌治疗面临的主要难题是早期诊断和晚期治疗。与正常组织相比，结直肠癌病变组织中miRNA-429表达差异有统计学意义，使其具有成为结直肠癌的生物学标记物潜力，并为结直肠癌的诊断提供帮助。随着生物治疗在晚期结直肠癌治疗中的应用，晚期结直肠癌患者总生存时间得到延长。miRNA-429对结直肠癌的发生、转移过程的诸多环节发挥重要调节作用，可以为生物治疗提供新的目标，并据此开发相应的生物治疗方案。同时，miRNA-429表达与结直肠癌淋巴结转移及肿瘤大小的相关性，对患者预后的相关性对治疗方案的制订具有一定的价值。

已有学者提出将SIAH1作为抗癌治疗的新靶点，且已经在肺癌及胰腺癌的细胞模型及动物模型中得以实现[30]。目前，干预SIAH1表达主要3个位点：①首先是SBD域及SIAH-SIAH间二聚化结构域。Phyllopod(PHYL)可以阻滞SBD域，减弱肿瘤细胞增生及转移扩散，但由于SIAH间SBD结构域保持者高度同源，基于PHYL开发SIAH1特异性药物将很困难[31]。②SIAH蛋白RING结构域的 N末端。干预RING域可以修复Ras信号通路并阻碍肿瘤进展。SIAH1与SIAH2的N末端不同，这让SIAH特异性阻滞剂成为可能。但干预RING域并未修复SIAH蛋白通过SBD或SIAH1/SIAH2异二聚体结合基质蛋白的能力。③SIAH单体蛋白的二聚化位点。但现阶段基于上述3个位点干预SIAH1的表达较困难。实验已经证实，miRNA-429可以靶向抑制SIAH1影响结直肠癌细胞增殖，这将丰富SIAH1的调控机制，为开发SIAH1特异药物及结直肠癌治疗措施提供新的思路。