莱菔硫烷激动Nrf-2抗炎症改善小鼠肾缺血再灌注损伤

黄 霖，廖盼丽，张 炯

(华中科技大学同济医学院附属武汉儿童医院，武汉市妇幼保健院儿科肾内，湖北武汉 430016)

缺血再灌注损伤(ischemia reperfusion injury, IRI)是发生急性肾损伤(acute kidney injury, AKI)的重要原因之一。肾脏IRI也是肾脏病研究的热点之一，但目前缺乏有效的预防和干预手段。肾小管上皮细胞的损伤和死亡是肾脏IRI中至关重要的环节。在肾脏IRI过程中，缺氧所致的钙超载、线粒体能量合成障碍、氧自由基生成增加等因素均可诱导肾小管上皮细胞的凋亡脱落[1-2]。这将促发天然免疫反应，募集并活化巨噬细胞和中性粒细胞，且启动获得性免疫反应，促使T淋巴细胞和NK细胞浸润肾脏组织，级联诱导肾脏组织中的炎症瀑布效应，进而促使肾脏功能发生障碍[3-4]。

莱菔硫烷(sulforaphane, SFN)是一种存在于十字花科植物中的天然异硫氰酸盐，具有较好的抗氧化应激活性和抗炎症活性。莱菔硫烷被报道具有抗癌和保护心脏的作用[5-6]，但其对肾IRI的作用与影响尚不清楚。因此，本研究拟基于小鼠肾IRI模型来探析莱菔硫烷对肾IRI的作用与机制。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器莱菔硫烷(SFN，HY-13755，图1)购于美国MCE公司，溶解于PBS(pH 7.4)。Nrf-2抗体(ab156883)、Keap-1抗体(ab119403)、p-iκBα抗体(ab133462)、iκBα抗体(ab32518)、p-p65抗体(ab86299)、GAPDH抗体(ab9485)和PCNA抗体(ab18197)均购自Abcam公司。TUNEL试剂盒(1684809，Roche)购于美国Roche公司。小鼠TNF-α ELISA试剂盒(CSB-E04741m)、小鼠IL-1β ELISA试剂盒(CSB-ET011614MO)和小鼠IL-6 ELISA试剂盒(CSB-E04639m)购自武汉华美公司。倒置荧光显微镜(TS100，Nikon公司，日本)，石蜡包埋机(Leica公司，德国)，石蜡切片机(Leica公司，德国)。

图1 莱菔硫烷的结构式

Fig.1 The formula for sulforaphane

1.2 实验动物及分组24只健康雄性C57小鼠(北京华阜康)，体质量15～22 g(动物合格证号410102013)，饲养于华中科技大学同济医学院附属儿童医院。随机分为4组(n=6)：假手术对照组(Ctrl)、肾缺血再灌注组(IRI)、莱菔硫烷干预肾缺血再灌注组(IRI+SFN)、莱菔硫烷单独给药组(SFN)。术前24 h对SFN处理组小鼠尾静脉注射500 μg/kg SFN[7]。Ctrl组和IRI组则尾静脉注射等体积的无菌PBS溶液。以无创血管夹夹闭小鼠双侧肾蒂45 min建立肾IRI模型，Ctrl组除不夹闭双侧肾蒂外其他操作同上，具体手术术式参考既往报道[8]。

1.3 生化检测在各组小鼠恢复肾脏血流灌注24 h以后，以40 mL/L水合氯醛麻醉处死小鼠。收集小鼠全血和肾组织标本。小鼠全血在2～8 ℃下3 000 r/min离心10 min后收集上层血清，分装存储于-80 ℃备用。取小鼠血清送医院检验科检测血清中肌酐(creatinine)和尿素氮(urea nitrogen)的水平。

1.4 肾脏病理检测留取的小鼠肾组织，取部分置于40 g/L多聚甲醛溶液中固定，剩余部分均存于-80 ℃。将固定好的小鼠肾组织进行石蜡包埋、切片，切片厚度为1.5 μm，再进行苏木素-伊红(HE)染色，光镜下观察肾组织的病理学变化。

1.5 TUNEL法检测细胞凋亡小鼠肾组织石蜡切片经二甲苯浸洗2次脱蜡，每次5 min，梯度乙醇脱水。用蛋白酶K工作液在37 ℃下封闭20 min，PBS洗2次。制备TUNEL反应混合液，处理组用50 μL TdT+450 μL荧光素标记的dUTP液混匀，反应在室温下处理10 min。加50 μL TUNEL反应混合液于标本上，在37 ℃下暗湿盒中反应1 h。PBS漂洗3次后，DAPI复染10 min，在荧光显微镜下观察细胞凋亡发生情况。激发光波长为450 nm，检测波长为520 nm。每个样本随机选择5个高倍视野，进行细胞计数计算凋亡指数。凋亡指数=TUNEL阳性细胞/总细胞数×100%。

1.6 ELISA法检测小鼠血清中TNF-α、IL-1β和IL-6水平分离出各组小鼠血清以后，按梯度制备相应的标准品溶液。将待测血清和标准品溶液按100 μL/孔加入预包被的酶标板里面，4 ℃过夜。弃上清后，PBST洗3次，每次2 min。加入100 μL生物素标记抗体，在37 ℃下孵育1 h。弃上清，PBST洗3次，每次2 min。加入100 μL TMB溶液，在37 ℃下避光孵育30 min。加入50 μL反应终止液，用酶标仪读取在450 nm下的各样本读数。

1.7 Western blot法检测小鼠肾组织中Nrf-2、Keap-1、p-iκBα、iκBα和p-p65的蛋白表达分别提取小鼠肾组织的总蛋白和细胞核蛋白，测定蛋白含量以后，分别取20 μg蛋白进行SDS-PAGE电泳分离。分离完毕后，转膜并封闭，总蛋白分别加入Nrf-2抗体、Keap-1抗体、p-iκBα抗体和iκBα抗体，选择GAPDH抗体作为内参抗体。细胞核蛋白分别加入p-p65抗体，选择PCNA抗体作为内参抗体。一抗在4 ℃下孵育过夜，TBST洗脱后，加入生物素化二抗在室温下孵育2 h，ECL显色并进行成像分析。

2 结 果

2.1 莱菔硫烷可改善缺血再灌注小鼠肾功能生化检测结果表明，与Ctrl组血肌酐[(50.41±6.19)μmol/L]和尿素氮[(38.40±11.55)μmol/L]水平相比，缺血再灌注组小鼠血肌酐水平升高[(108.01±27.96)μmol/L，P=0.007]、尿素氮水平升高[(106.00±12.35)μmol/L，P=0.002]，差异有统计学意义；而莱菔硫烷干预缺血再灌注小鼠后血肌酐水平降低到(87.01±10.98)μmol/L(P=0.016)，尿素氮水平降低到(76.60±14.23)μmol/L(P=0.008)，这提示莱菔硫烷可改善缺血再灌注损伤引起的小鼠肾功能。正常小鼠单独使用莱菔硫烷后，血肌酐和尿素氮水平并未升高(图2)。

图2 莱菔硫烷干预后小鼠的肾功能检测

Fig.2 Renal function test after intervention by sulforaphane

A：血肌酐；B：血尿素氮。与Ctrl组比较，#P<0.05。与IRI组比较，*P<0.05，**P<0.01。

2.2 莱菔硫烷可改善小鼠肾缺血再灌注损伤并减少肾小管上皮细胞凋亡TUNEL染色及其对应的凋亡指数也表明，与IRI组相比，IRI+SFN组和SFN组的小鼠肾脏发生凋亡的肾小管上皮细胞数量减少(图3A)。基于TUNEL染色的分析显示IRI组的凋亡指数是(51.67±7.63)%，而IRI+SFN组小鼠肾组织的凋亡指数降到了(12.33±2.52)%(P=0.018)，SFN组小鼠肾组织中凋亡指数下降到(2.33±1.52)%(P=0.023，图3B)。HE染色结果显示，IRI组小鼠肾小管发生明显扩张，间质水肿，刷状缘明显脱落，肾小管上皮细胞发生空泡变性和死亡。而莱菔硫烷干预后，缺血再灌注损伤引起的小鼠肾小管扩张减轻，肾小管上皮细胞空泡变性减轻，凋亡减少，刷状缘脱落明显减少(图3C)。

2.3 莱菔硫烷可降低缺血再灌注损伤小鼠血清中TNF-α、IL-1β和IL-6的水平ELISA检测结果显示，与Ctrl组比较，IRI组小鼠血清中TNF-α增至(506.20±148.93)pg/mL(P=0.003)、IL-1β增至(454.50±122.39)pg/mL(P=0.002)，IL-6的分泌量增至(243.20±87.78)pg/mL(P=0.005)，而莱菔硫烷治疗肾缺血再灌注损伤以后，小鼠血清中TNF-α降至(212.41±132.56)pg/mL(P=0.001)、IL-1β降至(189.03±75.18)pg/mL(P=0.003)，IL-6的分泌量降至(131.40±44.98)pg/mL(P=0.004)。且单独使用莱菔硫烷组小鼠血清中TNF-α、IL-1β和IL-6的水平较Ctrl组未见明显的增高(P>0.05，图4)。

2.4 莱菔硫烷增加缺血再灌注损伤小鼠肾组织中Nrf-2的表达Western blot检测小鼠肾组织总蛋白结果显示，与Ctrl组比较，IRI组小鼠肾组织中Nrf-2的表达量减少(P=0.002)；而莱菔硫烷治疗肾缺血再灌注损伤以后，小鼠肾组织中Nrf-2的表达量增加(P<0.001)。与Ctrl组比较，IRI组小鼠肾组织中Keap-1的表达量未见降低(P>0.05)，而莱菔硫烷治疗肾缺血再灌注损伤以后，小鼠肾组织中Keap-1的表达量也未见降低(P>0.05，图5)。

2.5 莱菔硫烷减少缺血再灌注损伤小鼠肾组织中p-iκBα和胞核内p-p65的表达Western blot检测小鼠肾组织总蛋白的结果显示，与Ctrl组比较，IRI组小鼠肾组织中p-iκBα的表达量增多(P<0.001)，而莱菔硫烷治疗肾缺血再灌注损伤的小鼠后肾组织中p-iκBα的表达量降低(P=0.003)。Western blot检测小鼠肾组织细胞核蛋白的结果显示，与Ctrl组比较，IRI组小鼠肾组织中p-p65的表达量增多(P=0.004)，而莱菔硫烷治疗肾缺血再灌注损伤小鼠后肾组织中p-p65的表达量降低(P=0.001，图6)。

3 讨 论

肾缺血再灌注损伤的发病机制涉及氧化应激与炎症反应。来源于十字花科植物的莱菔硫烷具有较好的抗氧化应激作用[9]，但其对肾缺血再灌注损伤的作用与机制尚不完全清楚。本研究观察到IRI组小鼠血肌酐和尿素氮水平均升高，而莱菔硫烷干预缺血再灌注小鼠以后血清血肌酐和尿素氮水平降低。IRI组小鼠肾小管发生扩张，肾小管上皮细胞发生空泡变性和死亡，刷状缘明显脱落。而莱菔硫烷干预后，缺血再灌注损伤引起的小鼠肾小管扩张减轻，肾小管上皮细胞空泡变性减轻，死亡减少，刷状缘脱落明显减少。IRI+SFN组的小鼠肾脏中发生凋亡的肾小管上皮细胞数量明显减少，这些结果都提示出莱菔硫烷可改善缺血再灌注损伤引起的小鼠肾损伤。

图3 莱菔硫烷干预后小鼠的病理检测

Fig.3 Pathologic detection of sulforaphane after intervention in mice

A：TUNEL染色；B：基于TUNEL染色的凋亡指数；C：HE染色(×200)。与IRI组比较，*P<0.05。

图4 莱菔硫烷干预后小鼠血清中炎症因子水平的变化

Fig.4 Changes of inflammatory factors in serum of mice after intervention with sulforaphane

与Ctrl组比较，#P<0.05。与IRI组比较，*P<0.05。

图5 莱菔硫烷干预后小鼠肾组织中Nrf-2和Keap-1的Western blot检测

Fig.5 Western blot detection of Nrf-2 and Keap-1 in renal tissues of mice after intervention with sulforaphane

A：Western blot检测结果；B：Nrf-2/GAPDH的吸光度分析；C：Keap-1/GAPDH的吸光度分析。与Ctrl组比较，#P<0.05。与IRI组比较，*P<0.05。

图6 莱菔硫烷干预后小鼠肾组织中总蛋白的Western blot检测

Fig.6 Western blot of kidney tissue of mice after intervention with sulforaphane

A：Western blot检测小鼠肾组织总蛋白中p-iκBα和iκBα表达；B：p-iκBα/iκBα的吸光度分析；C：Western blot检测小鼠肾组织核蛋白中p-p65和PCNA表达；D：p-p65/PCNA的吸光度分析。与Ctrl组比较，#P<0.05。与IRI组比较，*P<0.05，**P<0.01。

莱菔硫烷具有抗氧化应激的功能，抗氧化应激的作用主要通过影响Nrf-2信号通路来实现[10]。Nrf-2已经被证实在多种疾病中具有抗氧化应激从而保护机体的作用[11-13]。莱菔硫烷直接作用于Keap-1上的巯基而破坏Nrf-2-Keap-1复合体，或者激活MAPK信号通路使Keap-1发生磷酸化，最终导致Nrf-2从复合体中被释放出来，Nrf-2即可被激活而具有活性，然后发生核内转位，结合到ARE元件，参与转录激活Ⅱ相酶基因。醌氧化还原酶(NQO1)、谷胱甘肽硫转移酶(GST)、UDP-葡萄糖醛酸转移酶(UGT)等Ⅱ相酶在机体内均具有很好的解毒作用[14-15]。本研究发现，IRI组小鼠肾组织中Nrf-2的表达量减少，而莱菔硫烷治疗肾缺血再灌注损伤以后，小鼠肾组织中Nrf-2的表达量增加。IRI组小鼠肾组织中Keap-1的表达量未见降低，莱菔硫烷治疗肾缺血再灌注损伤以后，小鼠肾组织中Keap-1的表达量也未见降低。由此提示莱菔硫烷改善小鼠肾缺血再灌注损伤可能是通过影响Nrf-2相关信号而非Keap-1来实现的。

莱菔硫烷还具有潜在的抗炎作用。LIN等[16]报道莱菔硫烷可以通过Nrf-2途径抑制LPS诱导的小鼠腹腔巨噬细胞炎症反应。HEISS等[17]报道NFκB是莱菔硫烷调控抗炎作用的分子靶点。SUN等[18]也在肌营养不良的小鼠模型中发现莱菔硫烷可通过Nrf-2抑制NFκB而减弱肌肉的炎症。本研究观察到IRI组小鼠血清中炎症因子TNF-α、IL-1β和IL-6的分泌量增多，而莱菔硫烷治疗肾缺血再灌注损伤以后，小鼠血清中TNF-α、IL-1β和IL-6的分泌量降低。且单独使用莱菔硫烷组小鼠血清中TNF-α、IL-1β和IL-6的分泌量较于Ctrl组小鼠未见明显的增多。当炎症活跃时iκBα发生磷酸化，NFκB p65与iκBα发生解离，NFκB p65继而发生磷酸化转位进入细胞核启动下游炎症因子如TNF-α、IL-1β和IL-6的表达。我们在研究中发现IRI组小鼠肾组织中p-iκBα的表达量增多，而莱菔硫烷治疗肾缺血再灌注损伤以后，小鼠肾组织中p-iκBα的表达量降低。IRI组小鼠肾组织中p-p65的表达量增多，而莱菔硫烷治疗肾缺血再灌注损伤以后，小鼠肾组织中p-p65的表达量降低。该结果提示莱菔硫烷可以抑制iκBα发生磷酸化， 进而抑制NFκB p65的磷酸化转位进入细胞核并阻止其启动下游炎症因子如TNF-α、IL-1β和IL-6的表达，最终达到抗缺血再灌注损伤所致炎症的作用。我们将在莱菔硫烷对 Nrf-2介导的NFκB通路调控方面进行深入研究，为莱菔硫烷的临床应用前景打下基础。