miR-153-3p靶向TGFβ2对胶质瘤细胞侵袭、迁移及上皮间质转化的影响

石洪仁，陈礼刚

(西南医科大学附属医院神经外科，四川泸州 646000)

胶质瘤是原发于神经胶质细胞的肿瘤，是最常见的颅内恶性肿瘤。胶质瘤约占脑肿瘤和神经系统肿瘤的30%，但占所有脑恶性肿瘤的80%[1]。胶质瘤的治疗因细胞类型、恶性程度和肿瘤生长的位置而异，主要是手术、放疗和化疗的联合使用。尽管治疗手段不断进步，患者预后取得较大的改善，但整体治疗仍缺少突破性进展。因此寻找胶质瘤的治疗方法仍然是研究的热点。miRNA是长度为21～23个碱基组成的单链非编码RNA，参与细胞增殖、凋亡、脂质代谢和细胞分化等生命进程，与肿瘤的发生和发展密切相关。研究发现miR-153-3p靶向Snail能抑制黑色素瘤细胞的增殖和侵袭[2]，而抑制miR-153-3p的表达能促进黑色素瘤的生长和转移[3]。miR-153高表达能抑制非小细胞肺癌的侵袭和迁移，抑制乳腺癌细胞的上皮间质转化[4-5]。NIU等[6]研究显示，miR-153靶向转化生长因子β2(transforming growth factor-beta 2, TGFβ2)抑制骨肉瘤细胞的增殖和侵袭。YAN等[7]发现miR-153-3p能抑制胶质瘤细胞的增殖。但目前miR-153-3p对胶质瘤细胞侵袭、迁移和上皮间质转化的影响尚未见报道。本文以体外培养的人神经胶质瘤细胞SHG-44为实验对象，探索miR-153-3p与TGFβ2的靶向关系以及对SHG-44细胞侵袭、迁移和上皮间质转化的影响。

1 材料与方法

1.1 细胞系及实验材料人恶性脑胶质瘤SHG-44细胞购自美国菌种保藏中心(ATCC)；DMEM培养基和胎牛血清购自美国Hyclone公司；胰酶购自美国Gibco公司；miR-153-3p模拟物(mimic)和mimic阴性对照(NC)购自广州锐博公司；Trizol试剂盒为美国英杰生命技术有限公司产品；PrimeScript RT试剂盒购自北京宝日医生物技术有限公司；荧光素酶报告实验试剂盒购自美国Promega公司；TGFβ2慢病毒载体pLent- Puro-CMV由上海吉凯基因化学技术有限公司设计合成；慢病毒包装试剂盒购自北京英格恩生物公司；抗体TGFβ2、基质金属蛋白酶2(matrix metalloproteinase, MMP-2)、MMP-9、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)、神经钙黏蛋白(N-cadherin)、Snail-2、波形蛋白(Vimentin)、Twist和上皮钙黏蛋白(E-cadherin)购自英国Abcam公司。

1.2 实验方法

1.2.1人胶质瘤细胞SHG-44的培养 细胞接种于含100 mL/L胎牛血清的DMEM培养基中，培养条件为37 ℃、50 mL/L CO2的饱和湿度培养箱。当细胞覆盖率达80%～90%时进行传代，取对数生长期的细胞用于后续实验。

1.2.2细胞转染 将细胞接种于24孔板，当细胞覆盖率达60%左右时进行转染，mimic与转染试剂按照1∶2.5的比例重积分混合，添加到细胞培养液中，正常培养6 h后更换新鲜的培养基。转染48～72 h后，检测细胞转染效果。

1.2.3实时荧光定量PCR检测mRNA表达 将细胞分为：对照组、mimic NC组和miR-153-3p mimic组，分别做不同处理。miRNA mimic转染48 h后，收集细胞，使用RNA提取试剂按照步骤抽提各组SHG-44细胞总RNA，检测RNA的浓度、纯度和完整性。取1 μL样品逆转录cDNA，以20 μL的体系加入相应的引物、模板和试剂，每组设置3个复孔，反应条件为94 ℃预变性3 min；94 ℃变性4 s，56 ℃退火5 s，72 ℃延伸6 s，共40个循环。TGFβ2上游引物：5′-CCGCTGCACATCGTC-3′，下游引物：5′-CGTGGAAGGCGGTGATCAG-3′。以GAPDH为内参，用公式2-ΔΔCt计算miR-153-3p和TGFβ2 mRNA的相对水平。

1.2.4荧光素酶实验分析miR-153-3p与TGFβ2的靶向关系 利用Targetscan和miRDB预测miR-153-3p与TGFβ2 3′-UTR的结合位点，构建miR-153-3p结合位点的TGF-4野生型质粒和突变型荧光素酶报告载体。细胞接种于24孔板，培养24 h后在转染试剂作用下，将野生型质粒和突变型质粒分别与miR-153-3p mimic共转，设置3个复孔。转染24 h后，弃培养基，PBS洗3次，加100 μL的裂解液，室温下充分裂解。加LARII测萤火虫荧光素酶的活性；加Stop&Glo试剂，检测海肾荧光素酶活性，以萤火虫荧光素酶/海肾荧光素酶比值表示活性。

1.2.5Western blot检测蛋白表达 将细胞分为：对照组、miR-153-3p mimic组、pLV-TGFβ2组、miR-153-3p+TGFβ2组，做相应处理。miR-153-3p mimic转染SHG-44细胞72 h后收集细胞，用加蛋白酶抑制剂的裂解液冰上静置30 min，4 ℃下12 000 r/min离心30 min后取上清，Bradford法测定蛋白浓度。各组样品上样量为30 μg，聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，转膜；含5 g/L脱脂牛奶的封闭液室温下封闭1 h，加一抗4 ℃孵育过夜；TBST洗3次，每次10 min，加二抗，室温下孵育2 h，TBST洗膜后显影，Image J分析条带灰度值。

1.2.6体外侵袭实验检测miR-153-3p对SHG-44细胞侵袭能力的影响 miR-153-3p mimic转染48 h后，胰酶消化收集细胞，制成单细胞悬液，调整细胞密度为1×105/mL。无血清培养基稀释基质胶，取100 μL至上室，37 ℃无菌培养箱中风干；下室中加500 μL含100 mL/L胎牛血清的培养基，取200 μL单细胞悬液至上室。正常培养24 h后，擦去上层基质胶和细胞，吉姆萨染色。倒置显微镜下随机选择5个视野，计数并拍照。

1.2.7划痕实验检测miR-153-3p对SHG-44细胞迁移能力的影响 miR-153-3p mimic转染SHG-44细胞48 h后，胰酶消化收集细胞，制成单细胞悬液，接种于6孔板。当细胞覆盖率达90%左右时，用灭菌的10 μL枪尖垂直于孔板底部划平行直线。PBS洗3次，更换为无血清的培养基。正常条件下继续培养，于0、24 h时拍照，计算划痕闭合率。

1.3 统计学分析采用统计学软件SPSS 18.0分析实验数据。多组间比较使用单因素方差分析，两两比较使用LSD-t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 miR-153-3p mimic对SHG-44细胞中TGFβ2 mRNA水平的影响miR-153-3p mimic转染SHG-44细胞后，miR-153-3p的水平升高，提示转染成功；miR-153-3p mimic作用于SHG44细胞后，TGFβ2的mRNA水平降低(P<0.01，图1)。

2.2 miR-153-3p负向调控SHG-44细胞中TGFβ2蛋白表达miR-153-3p mimic转染SHG-44细胞后，Western blot结果显示TGFβ2蛋白表达降低(P<0.01)；miR-153-3p添加到TGFβ2高表达的SHG-44细胞后，细胞中TGFβ2的表达水平降低(P<0.01，图2)。

图1 实时荧光定量PCR检测miR-153-3p和TGFβ2 mRNA的表达情况

Fig.1 The expression of miR-153-3p and TGFβ2 mRNA detected by qRT-PCR (n=3)

与对照组相比，aP<0.01。

图2 Western blot检测TGFβ2蛋白的表达情况

Fig.2 The expression of TGFβ2 proteins detected by Western blot (n=3)

与对照组相比，aP<0.01；与pLV-TGFβ2组相比，bP<0.01。

2.3 miR-153-3p与TGFβ2的靶向关系Targetscan和miRDB分析结果显示，miR-153-3p与TGFβ2 3′-UTR间存在连续保守结合区域。双荧光素酶实验结果显示，miR-153-3p mimic与TGFβ2野生型报告载体共转到SHG-44细胞后，荧光素酶的活性减低(P<0.01)；将TGFβ2 3′-UTR结合位点突变后与miR-153-3p mimic共转，荧光素酶的活性没有明显变化(图3)。实验结果表明miR-153-3p与TGFβ2存在靶向关系。

2.4 miR-153-3p对SHG-44细胞侵袭能力的影响miR-153-3p mimic转染SHG-44细胞后，侵袭细胞数目减少(P<0.01)；pLV-TGFβ2组与对照组相比，侵袭细胞数目增加(P<0.01)；miR-153-3p+TGFβ2组与pLV-TGFβ2组相比，细胞中侵袭细胞数目减少(P<0.01，图4)。

图3 miR-153-3p与TGFβ2 3′-UTR靶向关系分析

Fig.3 Targeting relationship between miR-153-3p and TGFβ2 3′-UTR (n=3)

A：Targetscan预测miR-153-3p与TGFβ2 3′-UTR的结合情况；B：荧光素酶报告实验分析靶向关系。与对照组相比，aP<0.01。

2.5 miR-153-3p对SHG-44细胞迁移能力的影响miR-153-3p mimic转染SHG-44细胞后，划痕闭合率降低(P<0.01)；pLV-TGFβ2组与对照组相比，划痕闭合率升高(P<0.01)；miR-153-3p+TGFβ2组与pLV-TGFβ2组相比，划痕闭合率降低(P<0.01，图5)。

2.6 miR-153-3p对SHG-44细胞中迁移、侵袭相关蛋白的影响miR-153-3p mimic组与对照组相比，SHG-44细胞中MMP-2、MMP-9和VEGF的表达降低(P<0.01)；pLV-TGFβ2组与对照组相比，SHG-44细胞中MMP-2、MMP-9和VEGF的表达降低(P<0.01)；miR-153-3p+TGFβ2组与pLV-TGFβ2组相比，SHG-44细胞中MMP-2、MMP-9和VEGF的表达降低(P<0.01，图6)。

图4 体外侵袭实验检测miR-153-3p对SHG-44细胞侵袭能力的影响Fig.4 The effect of miR-153-3p on the invasion of SHG-44 cells measured by Transwell (n=3)与对照组相比,aP<0.01;与pLV-TGFβ2组相比,bP<0.01;Bar=50μm。

图5 划痕实验检测miR-153-3p对SHG-44细胞迁移能力的影响Fig.5 The effect of miR-153-3p on the migration of SHG-44 cells measured by wound healing assay (n=3)与对照组相比,aP<0.01;与pLV-TGFβ2组相比,bP<0.01;Bar=100μm。

图6 Western blot检测miR-153-3p对SHG-44细胞中转移相关蛋白表达的影响

Fig.6 The effect of miR-153-3p on the expression of metastasis-related proteins in SHG-44 cells measured by Western blot (n=3)

与对照组相比，aP<0.01；与pLV-TGFβ2组相比，bP<0.01。

2.7 miR-153-3p对SHG-44细胞中上皮间质转化相关蛋白的影响miR-153-3p mimic组与对照组相比，SHG-44细胞中N-cadherin、Snail-2、Vimentin和Twist的表达降低，E-cadherin的表达升高(P<0.01)；pLV-TGFβ2组与对照组相比，SHG-44细胞中N-cadherin、Snail-2、Vimentin和Twist的表达升高，E-cadherin的表达降低(P<0.01)；miR-153-3p+TGFβ2与pLV-TGFβ2组相比，SHG-44细胞中N-cadherin、Snail-2、Vimentin和Twist的表达降低，E-cadherin的表达升高(P<0.01，图7)。

3 讨 论

胶质瘤细胞是常见的脑恶性肿瘤，侵袭能力强，复发率和死亡率高。研究发现，TGFβ2在胶质瘤中高表达[8]，能促进胶质瘤细胞侵袭和迁移[9]。PENG等[10]研究显示，在胶质瘤细胞中miR-141通过靶向抑制TGFβ2从而抑制细胞的生长和转移。miR-153在多种肿瘤细胞中发挥着抑制肿瘤发展的作用。据报道，miR-153能靶向TGFβ2骨肉瘤细胞的增殖和侵袭[6]。本研究结果显示，miR-153-3p mimic转染胶质瘤细胞后，TGFβ2 mRNA和蛋白水平均降低。双荧光素酶实验分析显示miR-153-3p与TGFβ2存在靶向关系。接下来我们探讨miR-153-3p对胶质瘤SHG-44细胞侵袭和迁移的影响。

图7 Western blot检测miR-153-3p对SHG-44细胞中上皮间质转化相关蛋白表达的影响

Fig.7 The effect of miR-153-3p on the expression of EMT-related proteins in SHG-44 cells measured by Western blot (n=3)

与对照组相比，aP<0.01；与pLV-TGFβ2组相比，bP<0.01。

胶质瘤主要为侵袭性生长，手术切除难度较大，因此抑制胶质瘤细胞的转移是研究的热点。研究显示miR-153高表达能抑制肺癌细胞的增殖和侵袭，抑制胃癌细胞的转移[11-12]。李冠军等[13]发现，miR-153高表达抑制膀胱癌的侵袭和迁移。与上述结果类似，本文研究结果显示miR-153-3p mimic转染SHG-44细胞后，侵袭细胞数目减少，划痕闭合率降低。TGFβ2高表达能促进SHG-44细胞侵袭和迁移，缓解miR-153-3p对细胞侵袭和迁移的抑制作用。ZHANG等[14]发现，在胶质瘤细胞中下调TGFβ2的表达能抑制肿瘤细胞的侵袭。LI等[15]发现，长链非编码RNA抑制miR-153-3p的表达后，促进低氧诱导因子和VEGF的表达，促进缺氧状态下组织血管生成。在胶质瘤细胞中，TGFβ2通过调节基质金属蛋白酶来调节肿瘤细胞的侵袭[16]。VEGF、MMP-2和MMP-9在胶质瘤的侵袭过程中起促进作用，VEGF与肿瘤血管生成密切相关，而MMPs能降低细胞之间的连接。本研究结果显示，miR-153-3p mimic转染SHG-44细胞后，细胞中MMP-2、MMP-9和VEGF的表达水平显著降低。实验结果表明，miR-153-3p靶向TGFβ2抑制SGH-44细胞侵袭和迁移。

上皮间质转化是胚胎发育和肿瘤侵袭发生时的动态变化过程。XU等[17]的研究显示，下调miR-153促进人上皮癌细胞上皮间质转化和转移。据报道miR-153高表达能抑制肝癌细胞中N-cadherin、Vimentin、Snail的表达，抑制上皮间质转化[18]。本文结果与之类似，miR-153-3p mimic转染SHG-44细胞后，细胞中N-cadherin、Snail-2、Vimentin和Twist的表达水平降低，E-cadherin的表达升高。结果表明miR-153-3p抑制SHG-44细胞上皮间质转化。有文献报道miR-153-3p能通过靶向Snail抑制肿瘤细胞上皮间质转化。在实验中miR-153-3p是否直接靶向Snail发挥作用仍需要进一步验证。

miR-153-3p mimic抑制SHG-44细胞中TGFβ2 mRNA和蛋白的表达，荧光素酶实验显示miR-153-3p与TGFβ2的靶向关系，miR-153-3p mimic抑制SHG-44细胞侵袭和迁移、抑制上皮间质转化相关蛋白的表达；而TGFβ2高表达缓解miR-153-3p对侵袭和上皮间质转化相关蛋白表达水平的影响。综上所述，miR-153-3p靶向TGFβ2抑制体外培养的胶质瘤SHG-44细胞侵袭、迁移和上皮间质转化。下一步将在体内实验中研究miR-153-3p对胶质瘤生长和转移的影响。