miR-450b-5p在肝细胞癌中的表达及功能

张 雷，王宇锋，王 亮，殷国志，韩少山，李瑞祥，鲜 瑶，姚德茂

(1. 西安交通大学第一附属医院老年外科，陕西西安 710061；2. 西安交通大学第一附属医院肝胆外科，陕西西安 710061；3.西安交通大学第一附属医院营养科，陕西西安 710061)

肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是最常见的恶性肿瘤之一，具有较高的发病率和死亡率，严重威胁人类健康[1]。目前治疗HCC首选的措施仍然是手术切除，尽管HCC的诊治水平已经有了明显改善，但患者的总体预后仍然不容乐观[1-2]。因此，寻找新的有效的HCC临床诊治措施是目前最为迫切的任务之一。作为靶向治疗热点领域之一的微小RNA(microRNA, miRNA)是一类由内源基因编码的长度为18～25个核苷酸序列的小分子RNA，其在肿瘤的发生发展过程中有重要作用[3-5]。miRNA主要通过参与基因的转录后表达调控而调节肿瘤细胞的增殖、凋亡、侵袭和迁移等恶性生物学行为[6]。既往研究发现，miR-450b-5p与横纹肌肉瘤[7]、口腔鳞状细胞癌[8]、肺腺癌[9]、前列腺癌[10]以及结直肠癌[11]等恶性肿瘤的发生发展密切相关。ZHANG等[9]发现，miR-450b-5p可以作为LINC00319/miR-450b-5p/Zeste基因增强子人类同源物2(zeste gene enhancer of human homolog 2, EZH2)通路的一员参与肺腺癌恶性进展；SUN等[7]研究发现，在横纹肌肉瘤中，TGF-β1可以通过负向调控miR-450b-5p的表达发挥其作用。而有关miR-450b-5p在HCC中的表达及作用目前罕有报道。因此，本研究观察miR-450b-5p在HCC中的表达情况、临床意义及其对HCC细胞侵袭、迁移、增殖的影响，并初步探究其可能的作用机制，为HCC的预防和诊治提供一定的实验依据。

1 材料与方法

1.1 组织标本收集并筛选73例HCC组织和对应的癌旁组织标本，所有标本均来自2008年1月1日至2011年12月31日在西安交通大学第一附属医院接受手术治疗并经术后病理诊断确诊的HCC患者，其中男性62例，女性11例，年龄27～76岁，中位年龄51岁。癌旁组织为距肿瘤边缘大于2 cm的肝组织。所有患者术前均未接受放疗、化疗等其他辅助治疗。所有获得的新鲜组织取得后均尽快保存于液氮或者多聚甲醛(40 g/L)中。本研究获得西安交通大学第一附属医院伦理委员会审核批准并获得患者知情同意。

1.2 主要试剂Trizol试剂和脂质体(LipofectamineTM2000)均购自Invitrogen公司。胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)购自Gibco公司；DMEM购自ThermoFisher Scientific公司；miRNA逆转录试剂盒(All-in-OneTMmiRNA First-Strand cDNA Synthesis Kit)、miRNA qPCR试剂盒(All-in-OneTMmiRNA qPCR Kit)、miR-450b-5p特异性引物(货号：HmiRQP0508)、miRNA内参U6引物(货号：HmiRQP9001)、miR-450b-5p过表达类似物(miR-450b-5p mimics)(货号：HmiR0495-MR04)、miR-450b-5p抑制剂(miR-450b-5p inhibitors)(货号：HmiR-AN0508-AM01)均购自Genecopoeia公司；Transwell小室购自Becton Dickinson Labware公司；Matrigel基质胶购自BD公司；MTT试剂盒购自江苏凯基生物技术股份有限公司；RIPA裂解液(强)购自西安赫特生物科技有限公司；BCA蛋白定量试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司；兔抗人SOX2多克隆抗体购自Abcam公司；小鼠抗人β-actin单克隆抗体购自武汉博士德生物工程有限公司；ECL 发光剂购自Milipore 公司。

1.3 细胞培养与转染人正常永生化肝细胞(LO2)与肝癌细胞系(Hep3B、MHCC-97L、SMMC-7721、HepG2、MHCC-97H)均购自中科院上海生物化学与细胞生物学研究所。细胞培养液为含100 mL/L胎牛血清的DMEM培养液，恒温培养箱的条件为50 mL/L CO2、37 ℃。细胞转染参照LipofectamineTM2000试剂说明书步骤进行。将待转染细胞接种于6孔板中并培养至细胞融合度为50%～70%。转染前24 h，将正常血清更换为含100 mL/L胎牛血清无双抗的DMEM培养液。转染时，将100 nmol miR-450b-5p mimics(miR-450b-5p)与100 nmol阴性对照(miR-control)转染至MHCC-97H细胞；同时，将100 nmol miR-450b-5p inhibitors(anti-miR-450b-5p)与100 nmol阴性对照(anti-miR)转染至Hep3B细胞，转染试剂为LipofectamineTM2000。用含100 mL/L胎牛血清无双抗的DMEM培养液继续培养8 h，换成正常培养液进行培养，转染48 h收取细胞进行后续转染效果检测及相关功能实验。

1.4 Real-time PCR检测使用Trizol试剂，按照说明书上的步骤提取组织和细胞中的总RNA，并用超微量核酸定量光谱仪(Thermo Nanodrop 1000)测定RNA的浓度和纯度。逆转录操作分别按照miRNA逆转录试剂盒(All-in-OneTMmiRNA First-Strand cDNA Synthesis Kit)和逆转录试剂盒(RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit)说明书步骤进行。miRNA Real-time PCR按照miRNA qPCR( All-in-OneTMmiRNA qPCR Kit)试剂盒说明书步骤进行，以U6为内参。结果均应用2-△△Ct法计算。独立重复实验3次。

1.5 Transwell迁移和侵袭实验Transwell迁移实验时不铺胶；侵袭实验时，先将50 mg/L的Matrigel胶1∶6稀释后均匀铺于上层小室底部。将待测细胞消化、离心、重悬，使细胞密度为1×106/mL。在Transwell下层小室中加入700 μL含100 mL/L胎牛血清的完全培养基，取各组细胞悬液200 μL加入Transwell小室的上室。每组重复3次。48 h后取出小室，首先用PBS溶液将小室清洗3次，然后用棉签将小室的微孔膜上层的Matrigel胶及细胞轻轻拭净，接着用40 g/L多聚甲醛固定15 min，用1 g/L的结晶紫染色5 min，用PBS溶液洗净后将小室置于倒置显微镜下进行观察计数，每个样本随机选取5个视野进行计数并求其平均数，以此评估细胞的侵袭迁移能力。

1.6 MTT实验收集转染24 h的各组细胞，调整细胞悬液接种至96孔板(每孔3×103个细胞)。各组细胞分别设置3个复孔，继续培养。分别于接种24、48、72 h弃去培养基，每孔加入5 g/L的二苯基溴化四氮唑蓝(MTT)50 μL继续孵育4 h，加入200 μL二甲基亚枫(DMSO)进行终止。然后应用光吸收酶标仪(SpectraMax 190，美谷分子仪器公司)测定490 nm处的吸光度并进行分析。

1.7 细胞蛋白抽提及Western blot检测细胞转染48 h，用RIPA裂解液抽提各组细胞总蛋白，用BCA法进行蛋白定量。将待检测蛋白样品按每孔30 μg上样后行SDS-PAGE电泳，然后用湿转法将蛋白转移至PVDF膜上，用50 g/L脱牛奶粉液封闭2 h，加入相应的SOX2抗体(1∶1 000)或者β-actin抗体(1∶1 000)，4 ℃孵育过夜，取膜室温孵育30 min，用TBST溶液(TBS，1 mL/L Tween-20)洗膜，10 min×3次。分别加HRP标记的抗兔或抗小鼠二抗(1∶5 000)，室温孵育2 h。TBST(TBS，1 mL/L Tween-20)洗膜3次，10 min/次，暗室用ECL发光剂检测。

1.8 荧光素酶报告实验设计合成SOX2-3′-UTR的野生序列和突变序列并进行扩增，将扩增的片段分别转入pMIR-reporterTM的miRNA表达载体(Applied Biosystems)，构建能够表达荧光素酶的重组质粒；构建好的重组质粒分别与miR-450b-5p mimic 或miR-450b-5p inhibitors 共同转染MHCC-97H及Hep3B细胞，72 h收集细胞，严格按照Luciferase Reporter Gene Assay Kit 说明书操作实验。通过发光化学仪检测萤火虫和海肾荧光比值。

1.9 统计学分析应用SPSS 22.0等统计软件处理数据，计量资料以均数±标准差表示，使用的统计学方法包括单因素方差分析、t检验、Pearsonχ2检验、Kaplan-Meier法、Cox多因素回归分析法、Spearman相关性检验等；用Graphpad prism 6及Adobe PhotoShop CS6等软件进行图表绘制。P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 miR-450b-5p在HCC组织和癌旁组织中的表达Real-time PCR检测73例HCC组织和对应的癌旁组织中miR-450b-5p的表达结果显示，miR-450b-5p在HCC组织中相对表达水平(0.346±0.014)明显低于癌旁组织(0.913±0.024，P<0.05，图1)。

图1 Real-time PCR 检测miR-450b-5p在HCC组织(HCC)和癌旁组织(NT)中的表达变化

Fig.1 Expressions of miR-450b-5p in HCC tissues and adjacent non-tumor tissues (NT) measured by Real-time PCR

与NT组比较，*P<0.05。

2.2 HCC中miR-450b-5p的临床意义将73例HCC患者根据miR-450b-5p中位表达水平(0.340)分为miR-450b-5p高表达组(n=36)和miR-450b-5p低表达组(n=37)。应用卡方检验分析miR-450b-5p的表达量与两组患者临床病理特征间的相关性，结果显示，miR-450b-5p与肿瘤大小(P=0.026)、静脉侵犯(P=0.013)及TNM分期(P=0.020)显著相关，而与年龄、性别等特征无关(表1)。此外，应用Kaplan-Meier法分析结果显示，miR-450b-5p高表达组的HCC患者的总体生存率明显高于低表达组(图2)。

表1 miR-450b-5p的表达水平与HCC临床病理特征的关系

Tab.1 The correlation between miR-450b-5p expression and the clinicopathologic characteristics of HCC (n=73)

临床病理特征例数miR-450b-5p的表达水平高(n=36)低(n=37)χ2P年龄(岁) <50231013 ≥50502624性别 男623131 女11560.0770.781AFP水平(ng/mL) <4001697 ≥4005727300.3940.530肿瘤大小(cm) <5332112 ≥54015254.9420.026肿瘤数(个) 1603228 ≥213492.1760.140静脉侵犯 无513021 有226166.1210.013Edmondson病理分级 Ⅰ+Ⅱ472720 Ⅲ+Ⅳ269173.4910.062TNM分期 Ⅰ+Ⅱ543123 Ⅲ+Ⅳ195145.4360.020

图2 miR-450b-5p的表达水平与HCC患者预后的相关分析

Fig.2 The effect of miR-450b-5p expression on the prognosis of HCC patients

通过Cox多因素回归分析法进一步分析HCC患者的独立预后因素，结果发现，miR-450b-5p为HCC患者的独立预后因素之一(表2)。

2.3 miR-450b-5p在HCC细胞系中的表达情况Real-time PCR结果显示，5种HCC细胞系(Hep3B、MHCC-97L、SMMC-7721、HepG2、MHCC-97H)中的miR-450b-5p的表达水平均低于正常肝细胞LO2(P均<0.05，图3)。其中，MHCC-97H细胞表达最低，Hep3B的表达最高。因此，选择MHCC-97H和Hep3B细胞进行后续实验研究。

2.4 miR-450b-5p抑制HCC细胞迁移和侵袭Real-time PCR 检测结果显示，miR-450b-5p mimics能够上调MHCC-97H细胞中miR-450b-5p的表达水平(P<0.05)，而miR-450b-5p inhibitors能够下调Hep3B细胞中miR-450b-5p的表达水平(P<0.05，图4)。

表2Cox多因素回归分析法分析HCC患者的独立预后因素

Tab.2Coxregression analysis of the independent prognostic factors for HCC patients

临床因素单因素分析HR值P95% CI多因素分析HR值P95% CImiR-450b-5p的表达(高/低)2.8450.0251.367～4.4882.4230.0231.108～4.567年龄(岁)(<50/≥50)1.8840.6120.752～3.1680.8640.5120.522～1.54性别(男/女)2.3360.3661.378～5.6721.3620.4650.576～3.181AFP水平(ng/mL)(<400/≥400)3.9050.2410.429～6.6381.5650.1280.861～2.766肿瘤大小(cm)(<5/≥5)3.9780.0120.623～7.4651.4740.1420.893～2.430肿瘤数目(1/≥2)3.6710.0531.843～6.7541.1430.6280.679～1.889静脉侵犯(无/有)3.2230.0361.689～10.0642.2190.0130.083～3.779Edmondson病理分级(Ⅰ+Ⅱ/Ⅲ+Ⅳ)1.3680.0470.358～4.5121.2520.4530.722～2.167TNM分期(Ⅰ+Ⅱ/Ⅲ+Ⅳ)2.1160.0210.539～5.8471.5070.0160.715～4.846

Transwell迁移实验结果显示，相较于对照组，miR-450b-5p mimics能够明显抑制MHCC-97H细胞穿过小室膜的数目[P<0.001，(55.330±1.453)vs.(19.330±1.202)]；而转染miR-450b-5p inhibitors后的Hep3B细胞穿过小室膜的数目明显增多[P<0.001，(42.330±1.764)vs.(85.330±1.764)，图5]。

图3 Real-time PCR检测HCC细胞系中的miR-450b-5p的表达情况

Fig.3 The expression of miR-450b-5p in HCC cell lines detected by Real-time PCR

与LO2比较，*P<0.05。

Transwell侵袭实验结果显示，与对照组相比，miR-450b-5p mimics能明显抑制MHCC-97H细胞穿过小室膜[P<0.05，(35.000±1.155)vs.(11.670±1.764)]；而miR-450b-5p inhibitors能明显促进Hep3B细胞穿过小室膜[P<0.05，(24.330±1.202)vs.(52.670±1.453)，图6]。

图4 Real-time PCR检测转染miR-450b-5p mimics或者inhibitors后HCC细胞中miR-450b-5p的表达变化

Fig.4 Real-time PCR was used to detect the expression of miR-450b-5p in HCC cells transfected with miR-450b-5p mimics or inhibitors

与miR-control组比较，*P<0.05；与anti-control组比较，#P<0.05。

图5 Transwell迁移实验检测miR-450b-5p表达对HCC细胞迁移能力的影响

Fig.5 Effect of miR-450b-5p on HCC cells migration examined by Transwell migration assay

A、B：镜下观察(×200)；C、D：统计学分析。与miR-control组比较，*P<0.05；与anti-control组比较，#P<0.05。

2.5 miR-450b-5p抑制HCC细胞增殖MTT法检测结果显示，将miR-450b-5p mimics转染至MHCC-97H细胞48、72 h，细胞增殖明显抑制(P<0.05，图7A)；而转染miR-450b-5p inhibitors 48、72 h的Hep3B细胞的增殖明显增强(P<0.05，图7B)。

2.6 性别决定区Y框蛋白2(sex determining region Y-box2, SOX-2)是miR-450b-5p的靶基因应用生物信息学软件(Targetscan, microRNA.org, miRBase)预测miR-450b-5p的靶基因。miR-450b-5p能够与SOX2的3′非编码区(untranslated region, 3′-UTR)结合(图8A)，提示SOX2可能为miR-450b-5p的靶基因。荧光素酶报告实验结果显示，miR-450b-5p能负向调节野生型的SOX2-3′-UTR荧光素酶的活性，而对突变型的SOX2-3′-UTR的荧光素酶活性没有影响(P均<0.05，图8B)。进一步研究发现，与对照组相比，miR-450b-5p mimics明显降低MHCC-97H细胞中SOX2的蛋白水平(P<0.05，图8C)，而miR-450b-5p inhibitors明显上调Hep3B细胞中SOX2的蛋白水平(P<0.05，图8D)。

图6 Transwell侵袭实验检测miR-450b-5p表达对HCC细胞侵袭能力的影响

Fig.6 The effect of miR-450b-5p on HCC cells invasion examined by Transwell invasion assay

A、B：镜下观察(×200)；C、D：统计学分析。与miR-control组比较，*P<0.05；与anti-control组比较，#P<0.05。

图7 MTT法检测miR-450b-5p表达对HCC细胞增殖能力的影响

Fig.7 Effect of miR-450b-5p on HCC cells proliferation examined by MTT assay

与miR-control组比较，*P<0.05；与anti-control组比较，#P<0.05。

图8 HCC细胞中miR-450b-5p能够靶向作用于SOX2

Fig.8 SOX2 was the target of miR-450b-5p in HCC cells

A：生物信息学分析显示，miR-450b-5p可与野生型的SOX2的3＇非编码区结合(WT：野生型；MUT：突变型)；B：荧光素酶报告实验结果；C、D：Western blot结果。与miR-control组比较，*P<0.05；与anti-control组比较，#P<0.05。

3 讨 论

越来越多的研究表明，异常表达的miRNA与HCC细胞的发生发展密切相关[12-14]。ZHUANG等[15]研究发现，HCC中高表达的miR-23b能够通过靶向作用于肿瘤抑癌基因7L(suppression of tumorigenicity 7 like, ST7L)而促进肿瘤细胞迁移；ZHU等[16]研究表明，miR-10b在HCC中为高表达，能通过抑制CSMD1(CUB and Sushimultiple domains1)基因表达而发挥促HCC细胞侵袭迁移的作用；CAO等[17]研究表明，miR-101能够抑制HCC细胞的侵袭迁移，Girdin基因为其作用靶点。值得注意的是，近年来对食管癌、横纹肌肉瘤、口腔鳞状细胞癌、肺腺癌、前列腺癌及结直肠癌等多种恶性肿瘤的研究均表明，miR-450b-5p可能与肿瘤的侵袭、转移、增殖、化疗药物敏感性及患者预后等密切相关[7-11,18]。这提示miR-450b-5p可能与肿瘤发生发展密切相关，具有一定的潜在临床价值。但是，miR-450b-5p在HCC中研究目前尚罕有报道。

本研究发现miR-450b-5p在HCC组织和细胞系中表达均明显降低。而且miR-450b-5p低表达与肿瘤大小、静脉侵犯及TNM分期相关。此外，miR-450b-5p的表达水平与HCC患者的预后相关，miR-450b-5p高表达组的HCC患者预后较好，且miR-450b-5p表达水平为HCC患者的独立预后因素之一。上述结果表明，miR-450b-5p可能为HCC的抑癌基因，并且可能将作为判断HCC预后的临床指标。

为了探究miR-450b-5p对HCC细胞恶性生物学行为的影响，本研究检测了miR-450b-5p的表达改变对HCC细胞迁移、侵袭及增殖能力的影响。结果显示，当HCC细胞中miR-450b-5p的表达水平改变之后，HCC细胞的侵袭、迁移及增殖能力也随之出现负向改变。上述结果表明，miR-450b-5p为HCC的抑癌基因，能够抑制HCC细胞的侵袭、迁移和增殖。

大量研究表明，miRNA能够通过与下游靶基因的3′-UTR结合从而抑制靶基因的表达来发挥作用[9,15-16]。本研究采用的多种生物信息学工具(Targetscan, microRNA.org, miRBase)研究均显示，miR-450b-5p能够与SOX2 mRNA的3′-UTR结合，即SOX2为其潜在的靶基因。SOX2是SOX转录因子家族中一个主要成员，其对胚胎干细胞、神经干细胞以及肿瘤干细胞等干细胞的再生能力以及多能性的维持具有重要作用[19]。研究发现，SOX2在包括HCC在内的多种肿瘤中作为原癌基因参与肿瘤的生物进程中，其能够通过作用于Slug、cyclin-E、p27等基因促进肿瘤细胞的侵袭、转移、增殖能力[19-22]。因此，推测miR-450b-5p可能通过靶向作用于SOX2发挥其抗HCC的作用。为证实SOX2为miR-450b-5p的靶点，应用荧光素酶报告和Western blot实验验证，结果发现，miR-450b-5p能够通过与SOX2的3′-UTR直接结合从而负向调控HCC细胞中SOX2的表达。上述结果表明，HCC细胞中，SOX2是miR-450b-5p的靶基因。结合既往研究，推测HCC细胞中miR-450b-5p通过靶向作用于SOX2，进而影响SOX2对下游基因Slug、cyclin-E、p27等的调节，影响HCC细胞的迁移、侵袭以及增殖等。

综上所述，本研究通过一系列实验发现低表达的miR-450b-5p与HCC的肿瘤大小、静脉侵犯、TNM分期及HCC患者的不良预后密切相关。此外，miR-450b-5p能够通过靶向作用于SOX2抑制HCC细胞的迁移、侵袭和增殖能力。本研究将为HCC靶向治疗的相关研究提供一定的实验基础和理论依据。