白藜芦醇通过诱导细胞周期阻滞及细胞凋亡增强宫颈癌细胞的化疗敏感性

岳小丁，李秀娟，刘 青，杨捷玲

(1. 西京学院，陕西西安 710123；2. 西安医学院第二附属医院，陕西西安 719000)

宫颈癌是一种死亡率很高的妇科癌症，晚期或转移性宫颈癌患者的5年生存率仅为30%～50%，虽然大多数患者可以通过手术和放射治疗来治愈，但有相当数量的患者最终会出现复发性疾病。在过去的临床试验中，包括顺铂(cisplatin, CDDP)及卡铂在内的铂类化疗药物已成为复发或晚期宫颈癌的标准治疗方案。然而，其临床效果并不理想。其中一个重要原因是肿瘤细胞内的化学抗性[1-2]。因此，寻找一些可以增强癌细胞化疗敏感性的药物对宫颈癌的治疗至关重要。白藜芦醇(resveratrol)是一种天然植物抗毒素，大量分布于在葡萄和花生的皮及虎杖的根中，在各种组织损伤中发挥抗氧化、抗凋亡和抗炎等功能[3]。大量数据表明，白藜芦醇有利于糖尿病、心血管疾病及癌症的治疗[4-6]。但关于白藜芦醇在宫颈癌化疗敏感性中的作用报道还十分少见，有待进一步研究。本研究旨在探索白藜芦醇对宫颈癌细胞化疗敏感性的影响及其调控机制。

1 材料与方法

1.1 细胞系与主要试剂宫颈癌细胞Hela和宫颈癌耐CDDP细胞系Hela/DDP来源于美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection, ATCC)。培养基 DMEM及胎牛血清购自赛默飞世尔科技公司。白藜芦醇(HPLC≥99%)和CDDP购自美国Sigma公司。CCK-8细胞增殖及毒性检测试剂盒和Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒购自Solarbio。细胞周期检测试剂盒购自江苏碧云天生物技术有限公司。抗p21抗体、抗细胞周期蛋白依赖性激酶2(cyclin-dependent-kinase 2, CDK2)抗体、抗细胞周期蛋白D1(cyclinD1)抗体、抗caspase-9抗体、抗caspase-3抗体、抗B淋巴细胞瘤-2(B cell lymphoma 2, Bcl-2)抗体和抗Bcl-2相关蛋白X(Bcl-2-associated X protein, Bax)抗体购自英国Abcam公司。

1.2 细胞分组及药物处理Hela/DDP细胞分为4组：Hela/DDP组、resveratrol组、CDDP组、resveratrol+CDDP组。resveratrol组添加4 μg/mL白藜芦醇，CDDP组添加5 μg/mL CDDP，resveratrol+CDDP组同时添加4 μg/mL白藜芦醇和5 μg/mL CDDP。Hela/DDP组用DMSO进行处理。

1.3 Hela/DDP细胞活力及增殖检测用不同质量浓度(0、0.375、0.75、1.5、3、6、12、24、42、84、168 μg/mL)的CDDP单独或同时添加4 μg/mL白藜芦醇处理Hela和Hela/DDP细胞48 h后，收集各组细胞，用稀释到0.1 mL/L的CCK-8溶液将上述细胞制成1×106/mL的细胞悬液，并在37 ℃培养4 h，检测450 nm处的吸光值，计算细胞活力。在Hela/DDP细胞中单独或同时添加4 μg/mL的白藜芦醇和5 μg/mL的CDDP后，在处理0、24、48、72、96 h后，收集细胞，按照试剂盒说明书检测细胞增殖倍数。

1.4 Hela/DDP细胞周期检测单独或同时添加4 μg/mL的白藜芦醇和5 μg/mL的CDDP处理Hela/DDP细胞48 h后，收集各组待测细胞，用预冷的PBS洗涤2次，弃上清。再将乙醇加入细胞中，吹起混匀，4 ℃固定2 h。离心收集细胞，加入碘化丙啶(propidium iodide, PI)，缓慢并充分混匀，4 ℃避光孵育30 min。最后应用流式细胞仪进行检测。

1.5 Hela/DDP细胞凋亡检测单独或同时添加4 μg/mL的白藜芦醇和5 μg/mL的CDDP处理Hela/DDP细胞48 h后，各组待测细胞经预冷的PBS洗涤后用1×的Binding buffer将细胞制成1×106/mL的细胞悬液。加入Annexin V-fluorescein isothiocyanate(FITC)，混匀，室温，避光孵育10 min。再加入PI，室温，避光孵育5 min。利用流式细胞仪对染色的细胞进行检测。

1.6 Western blot法检测细胞周期相关蛋白及细胞凋亡相关蛋白的表达单独或同时添加4 μg/mL的白藜芦醇和5 μg/mL的CDDP处理Hela/DDP细胞48 h后，收集各组待测细胞，首先用PBS将细胞清洗3次后，加入含蛋白酶抑制剂的细胞裂解液进行裂解，提取总蛋白，100 ℃变性5 min。等量蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳分离并转至PVDF膜。0.05 g/mL的BSA封闭1 h后加入相应的一抗，4 ℃过夜孵育。第2天加入辣根过氧化物酶标记的二抗，室温孵育1.5 h。加入发光液后，于凝胶成像仪进行曝光拍照，统计灰度值，计算相对表达量。

2 结 果

2.1 白藜芦醇对宫颈癌细胞Hela和Hela/DDP化疗敏感性的影响为了分析Hela和Hela/DDP对CDDP的敏感性，利用CCK-8检测Hela和Hela/DDP细胞的细胞活力。图1A显示，当白藜芦醇浓度在4 μg/mL及其以下时，Hela/DDP细胞活力维持在80%以上，对细胞活力无影响；但当白藜芦醇浓度为4 μg/mL以上时，Hela/DDP细胞活力明显下降，维持在在80%以下。如图1B所示，Hela/DDP细胞对CDDP的敏感性低于Hela细胞，IC50值从(33.67±4.1)μg/mL降至(5.23±0.79)μg/mL(P<0.01)。白藜芦醇处理后，Hela/DDP细胞对CDDP的敏感性增强，IC50值降至(16.39±1.57)μg/mL(P<0.01)。

图1 白藜芦醇对宫颈癌细胞Hela和Hela/DDP化疗敏感性的影响

Fig.1 The effect of resveratrol on the chemosensitivity of Hela and Hela/DDP cells (n=5)

A: The effect of resveratrol on cell viability of Hela/DDP cells; B: The effect of resveratrol on the chemosensitivity of Hela and Hela/DDP cells

2.2 白藜芦醇对Hela/DDP细胞增殖的影响通过CCK-8检测Hela/DDP细胞的增殖倍数，分析白藜芦醇对Hela/DDP细胞增殖的影响。resveratrol组和CDDP组细胞增殖倍数低于Hela/DDP组(P<0.01)；与CDDP组相比，resveratrol+CDDP组细胞增殖倍数下降(P<0.01，图2)。

2.3 白藜芦醇对Hela/DDP细胞周期的影响利用流式细胞仪分析白藜芦醇对Hela/DDP细胞周期的影响。resveratrol组和CDDP组细胞发生G1期阻滞，处于G1期的细胞比例高于Hela/DDP组，处于G2和S期的细胞比例低于Hela/DDP组(P<0.01)；与CDDP组相比，resveratrol+CDDP组细胞G1期阻滞更加明显，处于G1期的细胞比例上升，处于G2和S期的细胞比例下降(P<0.01，图3)。

图2 白藜芦醇对Hela/DDP细胞增殖的影响

Fig.2 The effect of resveratrol on the proliferation of Hela/DDP cells (n=5)

与Hela/DDP组比较，**P<0.01；与CDDP组比较，##P<0.01。

2.4 白藜芦醇对Hela/DDP细胞凋亡的影响通过流式细胞术检测细胞凋亡，分析白藜芦醇对Hela/DDP细胞凋亡的影响。resveratrol组和CDDP组细胞凋亡率高于Hela/DDP组(P<0.01)。与CDDP组相比，resveratrol+CDDP组细胞凋亡率升高(P<0.01，图4)。

2.5 白藜芦醇对Hela/DDP细胞周期相关蛋白表达的影响为进一步分析白藜芦醇对Hela/DDP细胞周期相关蛋白表达的影响，Western blot检测p21、CDK2和CyclinD1表达。resveratrol组和CDDP组p21表达高于Hela/DDP组，CDK2和cyclinD1低于Hela/DDP组(P<0.01)；与CDDP组相比，resveratrol+CDDP组p21表达升高，CDK2和cyclinD1表达降低(P<0.01，图5)。

2.6 白藜芦醇对Hela/DDP细胞凋亡相关蛋白表达的影响为进一步分析白藜芦醇对Hela/DDP细胞凋亡相关蛋白表达的影响，Western blot检测caspase-3、caspase-9、Bcl-2和Bax表达。resveratrol组和CDDP组caspase-3、caspase-9和Bax表达高于Hela/DDP组，Bcl-2 表达低于Hela/DDP组(P<0.01)。与CDDP组相比，resveratrol+CDDP组caspase-3、caspase-9和Bax表达升高，Bcl-2表达下降(P<0.01，图6)。

图3 白藜芦醇对Hela/DDP细胞周期的影响

Fig.3 The effect of resveratrol on cell cycle of Hela/DDP cells (n=5)

与Hela/DDP组比较，**P<0.01；与CDDP组比较，##P<0.01。

图4 白藜芦醇对Hela/DDP细胞凋亡的影响

Fig.4 The effect of resveratrol on the apoptosis of Hela/DDP cells (n=5)

与Hela/DDP组比较，**P<0.01；与CDDP组比较，##P<0.01。

图5 白藜芦醇对Hela/DDP细胞周期相关蛋白表达的影响

Fig.5 The effect of resveratrol on the expression of cell cycle related proteins in Hela/DDP cells (n=5)

与Hela/DDP组比较，**P<0.01；与CDDP组比较，##P<0.01。

图6 白藜芦醇对Hela/DDP细胞凋亡相关蛋白表达的影响

Fig.6 The effect of resveratrol on the expression of apoptosis related proteins in Hela/DDP cells (n=5)

与Hela/DDP组比较，**P<0.01；与CDDP组比较，##P<0.01。

3 讨 论

目前对宫颈癌的治疗方法主要包括放疗、化疗和外科手术。自20世纪初以来，化疗就被广泛应用于治疗癌症，尤其是晚期癌症患者及复发性癌症患者。但由于其抗药性和副作用，化疗的临床应用受到严重限制[7-10]。因此，开发能够协同提高现有抗癌药物治疗效果的药物，对人类抗癌事业的发展至关重要。

癌细胞化疗敏感性的降低对癌症的治疗十分不利。越来越多的研究表明，白藜芦醇在提高癌细胞化疗敏感性方面发挥着积极作用。KIM等[11]发现白藜芦醇可增强乳腺癌耐药细胞MCF-7/ADR对阿霉素的敏感性。有数据显示，白藜芦醇可提高黑色素瘤细胞K1735和B16F10对CDDP的敏感性，也可提升非小细胞肺癌细胞H1703和H1975对依托泊苷的敏感性[12-13]。本研究结果表明，白藜芦醇可增强宫颈癌耐药细胞Hela/DDP对CDDP的敏感性。

细胞周期阻滞在癌细胞化疗敏感性中起着重要作用[14]。白藜芦醇可通过诱导细胞周期阻滞增强癌细胞的化疗敏感性。据报道，白藜芦醇可通过诱导细胞周期阻滞在S期，提高上皮样卵巢癌细胞A2780对CDDP的敏感性[15]。LEE等[16]发现，白藜芦醇可提高恶性间皮瘤MSTO-211H和MeT-5A细胞p21表达，使细胞周期阻滞在G1期。有文献报道，藜芦醇可诱导结直肠癌耐CDDP细胞HCT-116细胞周期阻滞在G0和S期[17]。本研究结果表明，白藜芦醇可提高CDDP对宫颈癌耐药细胞Hela/DDP的G1周期阻滞的作用，增强CDDP对p21表达的促进作用和对CDK2和cyclinD1表达的抑制作用。

细胞凋亡在癌细胞化疗敏感性中发挥着重要作用[18]。白藜芦醇可通过增强细胞凋亡提高癌细胞的化疗敏感性。ZHU等[19]发现，在非小细胞肺癌PC9/G细胞中，白藜芦醇可提高吉非替尼诱导的细胞凋亡，增强caspase-3表达。有数据显示，在乳腺癌耐泰莫西芬细胞MCF-7/TR中，白藜芦醇可促进MCF-7/TR细胞凋亡，提高caspase-3活性[20]。白藜芦醇还可以提高结肠直肠癌耐药细胞HCT116R细胞凋亡，增强caspase-3活性[21]。本研究结果表明，白藜芦醇可加强CDDP对宫颈癌耐药细胞Hela/DDP细胞凋亡的促进作用，提高CDDP对caspase-3、caspase-9和Bax表达的促进作用和对Bcl-2表达的抑制作用。

本研究表明，在宫颈癌耐CDDP细胞Hela/DDP中，白藜芦醇可提高Hela/DDP细胞对CDDP的敏感性；增强CDDP的细胞周期阻滞作用，促进p21表达，抑制CDK2和cyclinD1的表达；加强CDDP的促细胞凋亡作用，提高caspase-3、caspase-9和Bax表达，降低Bcl-2表达。

综上所述，白藜芦醇可通过诱导细胞周期阻滞和细胞凋亡增强Hela/DDP细胞对CDDP的敏感性。下一步将在活体内研究白藜芦醇对宫颈癌化疗敏感性的影响，为开发新的宫颈癌治疗策略提供理论依据。