TGF-β2诱导晶状体上皮细胞凋亡的机制

景瑞花，齐甜甜，张 明，岳嘉琦，王光妍，裴 澄，马 波

(西安交通大学第一附属医院眼科，陕西西安 710061)

晶状体后囊膜混浊(posterior capsular opacification, PCO)是白内障术后最主要的并发症。术后残留的晶状体上皮细胞(human lens epithelial cell, HLEC)转化为肌成纤维细胞(myofibroblast cell)作为其发病最主要机制已有相当多的研究。转化生长因子-β2(transforming growth factor β2, TGF-β2)被认为是引起PCO发生过程中最重要的细胞因子，本课题组前期研究发现，TGF-β2可以诱导Snial、Slug等转录因子及结缔组织生长因子、Gremlin等表达，通过激活ERK等信号通路，促进上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)以及细胞外基质(extracellular matrix, ECM)的合成，参与PCO的发生[1-6]。细胞凋亡是正常细胞的程序性死亡过程，存在于多细胞生物的整个生命过程中，主要分为外源性途径、线粒体途径、死亡受体途径[7]。1997年，KATO等[8]发现后发性白内障动物模型中伴随有细胞凋亡发生，且主要为转分化后的肌成纤维细胞凋亡，随后相继有学者确认了这一现象[9-10]，但尚缺乏具体机制的研究。本研究采用TGF-β2对体外培养的晶状体上皮细胞进行刺激，观察线粒体凋亡途径的相关蛋白及细胞周期变化，为探究后发性白内障过程中TGF-β2与细胞凋亡之间的关系提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料晶状体上皮细胞系(HLEC-B3，美国ATCC)，血清(FBS，以色列Biological Industries)，培养基DMEM(北京中科迈晨)，转化生长因子β2(TGF-β2，英国PeproTech)，Bax抗体(英国Abcam)，Bcl-2抗体(英国Abcam)，β-actin抗体(美国CST)，细胞周期检测试剂盒(上海碧云天)，Laemmli裂解液(美国Bio-Rad)，牛血清白蛋白(BSA，北京拜尔迪)，细胞凋亡检测试剂盒(美国Biolegend)。

1.2 方法

1.2.1细胞培养与传代 将冻存的人晶状体上皮细胞快速解冻后，复苏于含100 mL/L血清、10 mL/L双抗的完全低糖DMEM培养基中，置于50 mL/L CO2的37 ℃细胞培养箱中，当细胞增殖至70%时胰酶消化传代，每2～3 d换液或传代1次。

1.2.2Western blot检测蛋白表达 将细胞以1×106/瓶的数量均匀接种于6孔板，完全培养基培养。待细胞生长至70%密度时，换液并分别添加TGF-β2至终质量浓度为0、0.1、1、10 μg/L，继续培养24 h后收样。用Laemmli裂解液提取细胞总蛋白后100 ℃煮样10 min。配置120 g/L聚丙烯酰胺凝胶，电泳分离不同分子量蛋白，将目的蛋白转印至PVDF膜(Bio-Rad)上，用10 g/L BSA/TBST室温封闭1 h后，分别用Bax、Bcl-2、Caspase3一抗4 ℃过夜孵育。10 g/L BSA/TBST 3×10 min洗去未结合抗体，用辣根过氧化物酶标记的二抗室温孵育1 h，再用10 g/L BSA/TBST 3×10 min洗去未结合二抗，加ECL发光液(Bio-Rad)化学发光。

1.2.3流式细胞仪检测细胞凋亡 按照细胞凋亡检测试剂盒说明书操作，将晶状体上皮细胞接种于6孔板，加TGF-β2处理完成后，胰酶消化收集所有漂浮细胞及贴壁细胞，PBS洗3次，用100 μL Binding buffer重悬，再分别加APC-Annexin V 5 μL及PI 10 μL室温避光孵育15 min后，加400 μL Binding buffer终止反应，300目尼龙网过滤后上机检测。

1.2.4细胞周期分析 按照试剂盒说明操作，胰酶消化收集细胞后，PBS洗2次，700 mL/L乙醇4 ℃固定2 h，PBS洗2次。然后加PI染色液(染色缓冲液500 mL，PI 25 μL，RNAse A 10 μL)37 ℃避光孵育30 min。300目尼龙网过滤后即可用流式细胞仪检测。结果分析使用DNA Modeling Software。

1.3 统计学分析所有实验均重复3次，结果采用SPSS 22.0进行统计分析。两组间比较采用双尾t检验，计量资料以均数±标准差表示，多组间比较采用重复测量设计资料的方差分析(One-way ANOVA)，两组间比较用Dunnet’st检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 TGF-β2诱导激活线粒体依赖的凋亡通路Western blot检测结果显示，与空白对照组相比，随着TGF-β2浓度升高，线粒体依赖的凋亡通路蛋白Bax与Caspase3表达逐渐升高，呈浓度依赖性，而Bcl-2蛋白表达则逐渐减少。1 μg/L TGF-β2即可明显诱导Bcl-2/Bax蛋白表达量比值失衡(F=152.2,P<0.001)，亦可明显诱导总Caspase3蛋白表达(F=72.56，P<0.001)。见图1。

2.2 TGF-β2诱导细胞凋亡由于1 μg/L TGF-β2即可诱导凋亡相关蛋白表达，为具体研究TGF-β2诱导细胞凋亡的机制，后续采用更大剂量的5 μg/L TGF-β2进行实验。用流式细胞仪检测细胞发生凋亡情况，结果显示，5 μg/L TGF-β2可诱导体外培养的晶状体上皮细胞发生凋亡，早期凋亡与晚期凋亡细胞数量均增加，其中早期凋亡细胞数量增加更多。TGF-β2处理组(7.28±0.39)与对照组(4.15±0.29)相比，总凋亡细胞数差异有统计学意义(t=3.04，P=0.038)。见图2。

2.3 TGF-β2诱导细胞发生细胞周期阻滞细胞周期检测结果显示，5 μg/L TGF-β2刺激细胞不同时间(0、12、24、36 h)后，随时间延长，G1期及S期细胞数量均逐渐增加，G2期细胞数量逐渐减少(F=5.1,P=0.03)。表明TGF-β2处理可以导致细胞阻滞于G1/S期细胞周期检查点，可能因此诱导细胞凋亡。见图3。

图1 TGF-β2诱导晶状体上皮细胞Bcl-2、Bax及Caspase3蛋白的表达

Fig.1 Effects of TGF-β2 treatment on Bcl-2, Bax and Caspase3 expressions

与0组相比，***P<0.001,****P<0.0001。

图2 5 μg/L TGF-β2诱导晶状体上皮细胞凋亡

Fig.2 Effects of TGF-β2 on HLEC cell apoptosis

与对照组相比，*P<0.05。

图3 5μg/L TGF-β2诱导晶状体上皮细胞发生G1/S周期阻滞Fig.3 TGF-β2 induced G1/S cell cycle arrest与0h组相比,∗P<0.05。

3 讨 论

本研究结果显示，5 μg/L TGF-β2即可诱导细胞凋亡过程，且以早期凋亡为主。而用不同浓度的TGF-β2对细胞进行处理，发现促凋亡蛋白Bax和Caspase3的表达逐渐增高，而抑凋亡蛋白Bcl-2的表达减少，从而激活内源性线粒体依赖的Bax/Bcl-2-caspase3通路的凋亡，提示TGF-β2的变化与细胞凋亡的发生具有正相关性。TGF-β2刺激细胞36 h即可导致G1/S细胞周期阻滞，提示TGF-β2具有诱导HLECs凋亡的作用。

TGF-β是一类多效性细胞因子，在青光眼、角膜病及增生性玻璃体视网膜病变等疾病中具有促进ECM合成以及诱导细胞发生EMT的作用[11-13]。接受白内障手术的患者房水中TGF-β2表达明显升高，且大部分为活化状态[14]，这些活化的TGF-β2可以诱导白内障术后囊袋内残留的晶状体上皮细胞发生迁移、粘附、增殖、EMT及ECM合成，最终导致后囊膜混浊的发生[15-17]。TGF-β通常对正常细胞和肿瘤细胞有抑制增殖作用，而对成纤维细胞、平滑肌细胞等却又有促增生作用[18]。通常肿瘤细胞的EMT与其远处转移密切相关[19]，且EMT与凋亡诱导作用是相互抵抗的。所以，在肿瘤研究中，有学者以过量的TGF-β诱导肿瘤细胞凋亡而达到抑制其转移的作用。在后发性白内障中也有过类似的尝试。MALECAZE等[20]通过在细胞系中过表达Bax诱导细胞凋亡，从而清除剩余的晶状体上皮细胞，抑制EMT的发生。GEISSLER[21]在细胞培养过程中通过添加卡西霉素杀死所有细胞，从而抑制PCO的发生。但这些方法的安全性及有效性仍有待检验。肿瘤细胞的EMT只能暂时逃避凋亡，细胞凋亡也不是EMT的结局，因此，体内介导EMT的抗凋亡分子ERK/c-Src和促凋亡分子的平衡决定着细胞的命运[22]。PCO是一种伤口愈合伴随EMT及其他促纤维化因素的过程。HOSLER等[23]研究发现，TGF-β2可以诱导蛋白酶体途径的细胞凋亡及EMT，且其抑制剂MG132可有效阻断细胞TGF-β2诱导的凋亡及EMT特异性蛋白α-SMA的表达。这说明这种凋亡与EMT过程并不是独立存在或相互抵抗的，而是同时存在且相互作用的复杂过程。但其具体相互作用及机制并不清楚。

既往研究发现，TGF-β2具有促进HLEC增殖的作用[17]，而本研究结果显示，TGF-β2同样具有诱导细胞发生凋亡的作用，并且呈现正相关。既往研究证实，TGF-β2可以诱导HLEC发生EMT，并进一步促进转分化的HLEC大量增殖[17]，而在细胞发生EMT的过程中伴随着HLEC发生凋亡的过程，所以，TGF-β2促进HLEC发生增殖与凋亡并不矛盾。而且是在PCO发生过程中，EMT发生的同时伴随着细胞凋亡的发生，二者相互影响，相互作用。但对于EMT和细胞凋亡在PCO过程中的具体作用关系及机制，我们将在此基础上进一步研究。

总而言之，本研究证实了TGF-β2诱导的细胞凋亡通路，为进一步探索后发性白内障的发病机制提供了新的视角，也为PCO的治疗提供了新的方向。