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TGF-β2诱导晶状体上皮细胞凋亡的机制

2019-09-10景瑞花齐甜甜岳嘉琦王光妍

关键词:晶状体细胞周期白内障

景瑞花,齐甜甜,张 明,岳嘉琦,王光妍,裴 澄,马 波

(西安交通大学第一附属医院眼科,陕西西安 710061)

晶状体后囊膜混浊(posterior capsular opacification, PCO)是白内障术后最主要的并发症。术后残留的晶状体上皮细胞(human lens epithelial cell, HLEC)转化为肌成纤维细胞(myofibroblast cell)作为其发病最主要机制已有相当多的研究。转化生长因子-β2(transforming growth factor β2, TGF-β2)被认为是引起PCO发生过程中最重要的细胞因子,本课题组前期研究发现,TGF-β2可以诱导Snial、Slug等转录因子及结缔组织生长因子、Gremlin等表达,通过激活ERK等信号通路,促进上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)以及细胞外基质(extracellular matrix, ECM)的合成,参与PCO的发生[1-6]。细胞凋亡是正常细胞的程序性死亡过程,存在于多细胞生物的整个生命过程中,主要分为外源性途径、线粒体途径、死亡受体途径[7]。1997年,KATO等[8]发现后发性白内障动物模型中伴随有细胞凋亡发生,且主要为转分化后的肌成纤维细胞凋亡,随后相继有学者确认了这一现象[9-10],但尚缺乏具体机制的研究。本研究采用TGF-β2对体外培养的晶状体上皮细胞进行刺激,观察线粒体凋亡途径的相关蛋白及细胞周期变化,为探究后发性白内障过程中TGF-β2与细胞凋亡之间的关系提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料晶状体上皮细胞系(HLEC-B3,美国ATCC),血清(FBS,以色列Biological Industries),培养基DMEM(北京中科迈晨),转化生长因子β2(TGF-β2,英国PeproTech),Bax抗体(英国Abcam),Bcl-2抗体(英国Abcam),β-actin抗体(美国CST),细胞周期检测试剂盒(上海碧云天),Laemmli裂解液(美国Bio-Rad),牛血清白蛋白(BSA,北京拜尔迪),细胞凋亡检测试剂盒(美国Biolegend)。

1.2 方法

1.2.1细胞培养与传代 将冻存的人晶状体上皮细胞快速解冻后,复苏于含100 mL/L血清、10 mL/L双抗的完全低糖DMEM培养基中,置于50 mL/L CO2的37 ℃细胞培养箱中,当细胞增殖至70%时胰酶消化传代,每2~3 d换液或传代1次。

1.2.2Western blot检测蛋白表达 将细胞以1×106/瓶的数量均匀接种于6孔板,完全培养基培养。待细胞生长至70%密度时,换液并分别添加TGF-β2至终质量浓度为0、0.1、1、10 μg/L,继续培养24 h后收样。用Laemmli裂解液提取细胞总蛋白后100 ℃煮样10 min。配置120 g/L聚丙烯酰胺凝胶,电泳分离不同分子量蛋白,将目的蛋白转印至PVDF膜(Bio-Rad)上,用10 g/L BSA/TBST室温封闭1 h后,分别用Bax、Bcl-2、Caspase3一抗4 ℃过夜孵育。10 g/L BSA/TBST 3×10 min洗去未结合抗体,用辣根过氧化物酶标记的二抗室温孵育1 h,再用10 g/L BSA/TBST 3×10 min洗去未结合二抗,加ECL发光液(Bio-Rad)化学发光。

1.2.3流式细胞仪检测细胞凋亡 按照细胞凋亡检测试剂盒说明书操作,将晶状体上皮细胞接种于6孔板,加TGF-β2处理完成后,胰酶消化收集所有漂浮细胞及贴壁细胞,PBS洗3次,用100 μL Binding buffer重悬,再分别加APC-Annexin V 5 μL及PI 10 μL室温避光孵育15 min后,加400 μL Binding buffer终止反应,300目尼龙网过滤后上机检测。

1.2.4细胞周期分析 按照试剂盒说明操作,胰酶消化收集细胞后,PBS洗2次,700 mL/L乙醇4 ℃固定2 h,PBS洗2次。然后加PI染色液(染色缓冲液500 mL,PI 25 μL,RNAse A 10 μL)37 ℃避光孵育30 min。300目尼龙网过滤后即可用流式细胞仪检测。结果分析使用DNA Modeling Software。

1.3 统计学分析所有实验均重复3次,结果采用SPSS 22.0进行统计分析。两组间比较采用双尾t检验,计量资料以均数±标准差表示,多组间比较采用重复测量设计资料的方差分析(One-way ANOVA),两组间比较用Dunnet’st检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 TGF-β2诱导激活线粒体依赖的凋亡通路Western blot检测结果显示,与空白对照组相比,随着TGF-β2浓度升高,线粒体依赖的凋亡通路蛋白Bax与Caspase3表达逐渐升高,呈浓度依赖性,而Bcl-2蛋白表达则逐渐减少。1 μg/L TGF-β2即可明显诱导Bcl-2/Bax蛋白表达量比值失衡(F=152.2,P<0.001),亦可明显诱导总Caspase3蛋白表达(F=72.56,P<0.001)。见图1。

2.2 TGF-β2诱导细胞凋亡由于1 μg/L TGF-β2即可诱导凋亡相关蛋白表达,为具体研究TGF-β2诱导细胞凋亡的机制,后续采用更大剂量的5 μg/L TGF-β2进行实验。用流式细胞仪检测细胞发生凋亡情况,结果显示,5 μg/L TGF-β2可诱导体外培养的晶状体上皮细胞发生凋亡,早期凋亡与晚期凋亡细胞数量均增加,其中早期凋亡细胞数量增加更多。TGF-β2处理组(7.28±0.39)与对照组(4.15±0.29)相比,总凋亡细胞数差异有统计学意义(t=3.04,P=0.038)。见图2。

2.3 TGF-β2诱导细胞发生细胞周期阻滞细胞周期检测结果显示,5 μg/L TGF-β2刺激细胞不同时间(0、12、24、36 h)后,随时间延长,G1期及S期细胞数量均逐渐增加,G2期细胞数量逐渐减少(F=5.1,P=0.03)。表明TGF-β2处理可以导致细胞阻滞于G1/S期细胞周期检查点,可能因此诱导细胞凋亡。见图3。

图1 TGF-β2诱导晶状体上皮细胞Bcl-2、Bax及Caspase3蛋白的表达

Fig.1 Effects of TGF-β2 treatment on Bcl-2, Bax and Caspase3 expressions

与0组相比,***P<0.001,****P<0.0001。

图2 5 μg/L TGF-β2诱导晶状体上皮细胞凋亡

Fig.2 Effects of TGF-β2 on HLEC cell apoptosis

与对照组相比,*P<0.05。

图3 5μg/L TGF-β2诱导晶状体上皮细胞发生G1/S周期阻滞Fig.3 TGF-β2 induced G1/S cell cycle arrest与0h组相比,∗P<0.05。

3 讨 论

本研究结果显示,5 μg/L TGF-β2即可诱导细胞凋亡过程,且以早期凋亡为主。而用不同浓度的TGF-β2对细胞进行处理,发现促凋亡蛋白Bax和Caspase3的表达逐渐增高,而抑凋亡蛋白Bcl-2的表达减少,从而激活内源性线粒体依赖的Bax/Bcl-2-caspase3通路的凋亡,提示TGF-β2的变化与细胞凋亡的发生具有正相关性。TGF-β2刺激细胞36 h即可导致G1/S细胞周期阻滞,提示TGF-β2具有诱导HLECs凋亡的作用。

TGF-β是一类多效性细胞因子,在青光眼、角膜病及增生性玻璃体视网膜病变等疾病中具有促进ECM合成以及诱导细胞发生EMT的作用[11-13]。接受白内障手术的患者房水中TGF-β2表达明显升高,且大部分为活化状态[14],这些活化的TGF-β2可以诱导白内障术后囊袋内残留的晶状体上皮细胞发生迁移、粘附、增殖、EMT及ECM合成,最终导致后囊膜混浊的发生[15-17]。TGF-β通常对正常细胞和肿瘤细胞有抑制增殖作用,而对成纤维细胞、平滑肌细胞等却又有促增生作用[18]。通常肿瘤细胞的EMT与其远处转移密切相关[19],且EMT与凋亡诱导作用是相互抵抗的。所以,在肿瘤研究中,有学者以过量的TGF-β诱导肿瘤细胞凋亡而达到抑制其转移的作用。在后发性白内障中也有过类似的尝试。MALECAZE等[20]通过在细胞系中过表达Bax诱导细胞凋亡,从而清除剩余的晶状体上皮细胞,抑制EMT的发生。GEISSLER[21]在细胞培养过程中通过添加卡西霉素杀死所有细胞,从而抑制PCO的发生。但这些方法的安全性及有效性仍有待检验。肿瘤细胞的EMT只能暂时逃避凋亡,细胞凋亡也不是EMT的结局,因此,体内介导EMT的抗凋亡分子ERK/c-Src和促凋亡分子的平衡决定着细胞的命运[22]。PCO是一种伤口愈合伴随EMT及其他促纤维化因素的过程。HOSLER等[23]研究发现,TGF-β2可以诱导蛋白酶体途径的细胞凋亡及EMT,且其抑制剂MG132可有效阻断细胞TGF-β2诱导的凋亡及EMT特异性蛋白α-SMA的表达。这说明这种凋亡与EMT过程并不是独立存在或相互抵抗的,而是同时存在且相互作用的复杂过程。但其具体相互作用及机制并不清楚。

既往研究发现,TGF-β2具有促进HLEC增殖的作用[17],而本研究结果显示,TGF-β2同样具有诱导细胞发生凋亡的作用,并且呈现正相关。既往研究证实,TGF-β2可以诱导HLEC发生EMT,并进一步促进转分化的HLEC大量增殖[17],而在细胞发生EMT的过程中伴随着HLEC发生凋亡的过程,所以,TGF-β2促进HLEC发生增殖与凋亡并不矛盾。而且是在PCO发生过程中,EMT发生的同时伴随着细胞凋亡的发生,二者相互影响,相互作用。但对于EMT和细胞凋亡在PCO过程中的具体作用关系及机制,我们将在此基础上进一步研究。

总而言之,本研究证实了TGF-β2诱导的细胞凋亡通路,为进一步探索后发性白内障的发病机制提供了新的视角,也为PCO的治疗提供了新的方向。

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