高效液相色谱法测定维格列汀R型异构体的含量

刘宏果，张之奎

(石家庄鹏海制药股份有限公司，河北 050600)

维格列汀(vildagliptin)是诺华制药公司开发的一种口服抗糖尿病新药，属于二肽基肽酶-4(DPP-4)抑制剂，于2007年9月在欧盟批准上市，2011年8月CFDA批准其制剂在我国上市。化学名称为1-{[(3-羟基-1-金刚烷基)氨基]乙酰基}-2-氰基-(S)-四氢吡咯烷[1，2]，结构式见图1。由图1看出，该药分子中含有手性中心，目前R型异构体的检测方法未见报道，本研究工作使用高效液相色谱法，采用外标法对维格列汀中R型异构体含量进行检测，研究其检测条件，建立了一种可靠的检测方法。

1 仪器与试药

LC-10A型高效液相色谱仪(日本岛津公司)；AUW120D型分析天平(日本岛津公司)；Chiralpak IC(250 mm×4.6 mm，5 μm)手性色谱柱。维格列汀R型异构体对照品(批号DZ141001，纯度99%)、维格列汀对照品(批号DZ141101，纯度99%)、维格列汀(批号14110，1141102，141103)均由石家庄康贺威药业有限公司提供；乙醇(天津市科密欧化学试剂有限公司)、正己烷(天津市科密欧化学试剂有限公司)、叔丁基胺(北京百灵威科技有限公司)均为色谱纯。

2 方法与结果

2.1色谱条件 色谱柱：Chiralpak IC(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：乙醇-正己烷-叔丁基胺(90∶10∶10.1)；流速：0.7 ml/min；柱温：25 ℃；检测波长：210 nm；进样体积：10 μl。

2.2溶液制备

2.2.1供试品溶液 取本品20 mg，精密称定，置10 ml量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。

2.2.2对照品溶液 取维格列汀R型异构体对照品约10 mg，精密称定，置50 ml量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，即为维格列汀R型异构体对照品储备液；再精密量取1.00 ml置100 ml量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。

2.2.3系统适用性溶液 取维格列汀对照品200 mg，精密称定，置100 ml量瓶中，精密加入1 ml异构体对照品储备液，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，作为系统适用性溶液。

2.3系统适用性试验 精密量取空白溶剂、对照品溶液、系统适用性溶液和供试品溶液各10 μl,按“2.1”项下色谱条件进样测定，结果空白溶剂在维格列汀及R型异构体出峰位置不出峰，空白溶剂不干扰R型异构体的测定；系统适用性溶液中维格列汀与其R型异构体的分离度大于1.6，维格列汀峰的理论塔板数大于2 000。见图2。

1.维格列汀异构体 2.维格列汀

2.4线性试验 精密称取维格列汀R异构体对照品适量，加流动相溶解并稀释成含异构体0.4、0.8、1.2、1.6、2.0和2.4 μg/ml的溶液，分别进样10 μl，按“2.1”项下色谱条件测定，以维格列汀R型异构体浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，进行线性回归，线性方程为Y=8 882.4X-1 103.4(r=0.999 4)。结果表明维格列汀R型异构体在浓度0.4～2.4 μg/ml范围内线性关系良好。

2.5检测限 精密量取维格列汀R型异构体对照品储备液逐级稀释至信噪比(S/N)约为3时，计算检测限为1.3 ng。

2.6定量限 精密量取R型异构体对照品储备液逐级稀释至信噪比(S/N)约为10时，计算定量限为4.0 ng。

2.7重复性试验 取同一批号样品6份，分别按“2.2.1”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件测定。结果均未检出异构体，本法测定维格列汀中异构体重复性良好。

2.8精密度试验 取异构体对照品溶液连续进样5次，峰面积RSD为1.4%，符合规定，说明本法测定维格列汀中异构体精密度良好。

2.9溶液稳定性试验 室温条件下分别于0、2、4、6、8、10和14 h进样，对照品和回收率试验溶液中异构体峰面积的RSD分别为1.0%和1.1%，均小于2%，溶液稳定性良好。

2.10回收率试验 制备限度浓度的异构体溶液80%、100%和120%的9份不含维格列汀异构体的维格列汀样品加标溶液进行评价(每个浓度3份)，结果维格列汀异构体的平均回收率为97.1%，RSD为2.2%(n=9)，说明该方法准确度较高。见表1。

表1 维格列汀异构体回收率试验结果(n=9)

2.11样品检测 取批号为141101、141102和141103的3批维格列汀原料药，按“2.2.1”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进行检测，外标法计算异构体含量。3批样品均未检出其R型异构体。

2.12稳定性试验 将三批维格列汀原料置加速(温度40 ℃，湿度75%)及长期稳定性试验箱(温度25 ℃，湿度60%)放置，于加速1月、加速2月、加速3月、加速6月、长期3月和长期6月取样进行检测，均未检出异构体，说明维格列汀质量稳定。

3 讨论

3.1流动相的选择 由于维格列汀为碱性样品，在试验过程中优先考虑采用流动相乙醇-二乙胺(100∶0.2)，配制1 mg/ml维格列汀及其R型异构体的混合溶液，二者分离度只有1.3，调整流动相比例为乙醇-正己烷-叔丁基胺(90∶10∶0.2)，维格列汀出峰时间合适，但色谱峰峰高只有50，达不到灵敏度检测要求。考虑微调流动相，改为乙醇-正己烷-叔丁基胺(90∶10∶0.1)和乙醇-正己烷-叔丁基胺(90∶10∶0.3)配制系统适用性溶液，分别进样，流动相为乙醇-正己烷-叔丁基胺(90∶10∶0.1)的维格列汀峰高明显比流动相为乙醇-正己烷-叔丁基胺(90∶10∶0.3)的峰高高。所以选择乙醇-正己烷-叔丁基胺(90∶10∶0.1)为流动相。系统适用性试验中异构体与维格列汀峰分离良好，分离度达到2.3，异构体峰在限度浓度下检出明显，能达到灵敏度检测要求。见图3和图4。

1.维格列汀R型异构体 2.维格列汀

1.维格列汀R异构体 2.维格列汀

3.2检测波长的选择 取维格列汀对照品溶液进行紫外全波长扫描，维格列汀在196 nm有最大吸收，考虑到流动相的紫外截止波长，将检测波长确定为210 nm。

3.3柱温的选择 精密量取系统适用性溶液分别于柱温25和30 ℃注入液相色谱仪，记录色谱图。维格列汀与其R型异构体的分离度分别为2.3和1.8，均符合要求，最终将柱温确定为25 ℃。

采用高效液相色谱法测定维格列汀中R型异构体含量，色谱柱为Chiralpak IC(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相为乙醇-正己烷-叔丁基胺(90∶10∶0.1)；流速为0.7 ml/min；柱温为25 ℃；检测波长210 nm。维格列汀与其R型异构体峰分离良好，异构体在0.4～2.4 μg/ml范围内，浓度与峰面积呈良好的线性关系，异构体的定量限为4.0 ng，检测限为1.3 ng。该方法简便易行，灵敏度高，可用于维格列汀R型异构体含量的检测。