高效液相色谱法同时测定金佛止痛丸中的3种成分
2019-09-10邱连建
王 银,邱连建
(广东深圳市龙岗区中医院,广东 518033)
金佛止痛丸收载于《中国药典》一部[1],由白芍、醋制延胡索、佛手、三七、郁金、姜黄与甘草7味中药组成,具有行气止痛、舒肝和胃、祛瘀生新的功效,用于气血瘀滞所致的胃脘疼痛,痛经及消化性溃疡、慢性胃炎引起的疼痛[2]。文献报道[3-5]与《中国药典》只对单个成分进行控制,并不能客观地反应其质量。本试验建立了高效液相色谱法同时测定芍药苷、三七皂苷R1、延胡索乙素3种指标成分的含量;该方法高效、准确,可用于金佛止痛丸的质量控制。
1 仪器与试药
1.1仪器 Agilent 1260 液相色谱仪,安捷伦公司;XS205DU十万分之一电子天平,梅特勒托利多公司;SB-5200DTS超声波清洗机,宁波新芝生物科技有限公司。
1.2试药 芍药苷对照品(批号110736-201842,含量97.4%)、延胡索乙素对照品(批号110726-201819,含量99.8%)、三七皂苷R1对照品(批号110745-201820,含量93.1%)均购于中国食品药品检定研究院;金佛止痛丸,规格5 g/袋,批号171212、180611、181118,广州白云山中一药业有限公司。乙腈与甲醇均为色谱纯(美国西格玛公司),磷酸二氢钠为分析纯。
2 方法与结果
2.1色谱条件 色谱柱为安捷伦XBRIDGE-C18(250 mm×4.6 mm,5 μm);流动相A为乙腈-甲醇(1∶1),流动相B为0.01 mol/L磷酸二氢钠,梯度洗脱:0~10 min,10% A;10~44 min,10%→40% A;44~50 min,10% A;流速为 1.0 ml/min;柱温为 45 ℃;分段变波长测定:0~20.0 min为230 nm,20.0~32.0 min为280 nm,32.0~50.0 min为203 nm;进样20 μl。
2.2溶液的制备
2.2.1混合对照品溶液 精密称取芍药苷、延胡索乙素、三七皂苷R1适量,分别置50 ml量瓶中,加乙醇溶解并稀释至刻度,得各对照品储备液。再精密吸取各对照品储备液适量置同一50 ml量瓶中,乙醇稀释至刻度,得含芍药苷 1 000 μg/ml、延胡索乙素 20 μg/ml、三七皂苷R1250 μg/ml的混合对照品溶液,备用。
2.2.2供试品溶液 取金佛止痛丸适量,研细,取约0.5 g,精密称定,置 500 ml量瓶中,加乙醇适量,超声处理(功率 300 W,频率40 kHz) 30 min,放冷,加乙醇稀释至刻度,摇匀,滤过,取续滤液,即得。
2.2.3阴性对照溶液 按金佛止痛丸处方比例和工艺,分别制备缺少白芍、延胡索、三七药材的阴性对照样品;并按供试品溶液制备方法制备各阴性对照溶液。
2.3系统适用性试验 分别取对照品溶液、供试品溶液、缺白芍、缺延胡索及缺三七的阴性对照溶液,按照“2.1”项下所述的色谱条件进行测定,芍药苷、延胡索乙素、三七皂苷R1分离度均符要求,阴性样品溶液对测定无干扰。色谱图见图1。
1.芍药苷 2.延胡索乙素 3.三七皂苷R1
2.4线性关系试验 精密吸取按“2.2.1”项下混合对照品溶液1.0、2.0、4.0、6.0、8.0和10.0 ml,分别置 100 ml 量瓶中,以乙醇定容,摇匀,即得系列质量浓度的混合对照品溶液。分别吸取上述系列混合对照品溶液各20 μl,注入液相色谱仪,按照“2.1”项下的色谱条件测定,记录色谱图。以峰面积积分值(Y)对质量浓度(X)进行线性回归,得回归方程,见表1。
表1 线性回归方程
2.5精密度试验 按照“2.1”项下的色谱条件测定混合对照品溶液,重复进样6次,记录芍药苷、延胡索乙素和三七皂苷R1的峰面积。试验显示,芍药苷、延胡索乙素和三七皂苷R1峰面积的RSD值分别为0.7%、1.8%和0.8%,均小于2.0%,表明该方法的精密度符合要求。
2.6重复性试验 取同一批金佛止痛丸(批号171212)6 份,按照“2.2.2”项下方法制备供试品溶液,按“2.1”项下色谱条件进行测定,试验结果显示,芍药苷、延胡索乙素和三七皂苷R1的质量分数分别为8.114、0.138和1.734 mg/g,RSD 分别为0.4%、1.5%和0.7%,均小于2.0%,表明该方法的重复性符合要求。
2.7稳定性试验 取供试品溶液(批号171212),按“2.1”项下所述的色谱条件,分别放置0、2、4、6、8和12 h 后进样测定,试验显示芍药苷、延胡索乙素和三七皂苷R1质量分数的RSD分别为1.1%、1.9%和1.2%,均小于2.0%,表明供试品溶液在12 h内基本稳定。
2.8准确度试验 取同一批金佛止痛丸(批号为171212)(芍药苷含量8.1 mg/g、延胡索乙素含量0.13 mg/g、三七皂苷R1含量1.7 mg/g)9份,每份约1.0 g,精密称定,分成3组,每组分别加入0.8、1.0和1.2 ml对照品溶液(芍药苷含量8.125 mg/ml、延胡索乙素含量0.135 mg/ml、三七皂苷R1含量1.740 mg/ml),按“2.2.2”项下方法制备,按“2.1”项下色谱条件测定,计算回收率。结果芍药苷、延胡索乙素和三七皂苷R1的平均回收率分别为99.83%、101.18%和99.96%,RSD分别为0.24%、1.24%和0.79%。见表2-4。
表2 芍药苷加样回收率试验结果(n=9)
表3 延胡索乙素加样回收率试验结果(n=9)
表4 三七皂苷R1加样回收率试验结果(n=9)
2.9样品测定结果 取3批样品,按“2.2.2”项下所述方法进行供试品溶液的制备,按“2.1”项下所述色谱条件测定,外标法计算供试品中芍药苷、延胡索乙素和三七皂苷R1的含量,结果3批样品芍药苷平均含量为8.121 mg/g,RSD为0.01%;延胡索乙素平均含量为0.135 mg/g,RSD为2.61%;三七皂苷R1平均含量为1.738 mg/g,RSD为0.26%。见表5。
表5 样品中3种成分的含量
3 讨论
中成药的成分相对于化学药成分比较复杂,《中国药典》中对单一成分的控制并不能客观地评价其质量。本试验首次建立了高效液相色谱法同时测定金佛止痛丸中芍药苷、延胡索乙素和三七皂苷R13种指标成分的测定方法。对于多指标的控制,色谱方法的开发尤为重要。本试验结合相关文献与《中国药典》方法,对色谱方法进行了系统开发,包括色谱柱的选择和流动相的优选。同时对于样品的制备方法进行了优化,特别是对提取溶剂与提取方式进行了考查,最终确定试验中的制备方法。在后续的研究中将进一步进行有效成分的筛选,建立更加有效与准确的定量方法。