不同抗阻训练方案对T淋巴细胞亚群迁移和凋亡的影响

王焱源

摘  要：目的：探讨一次不同抗阻训练方案对外周血CD4+和CD8+T淋巴细胞亚群迁移和凋亡的影响。方法：15名无训练经历的健康青年男性分别进行一次以促进肌肉肥大（H-RT组，方案：70%1RM，10RM，3组，组间间歇1.5 min）和以改善肌肉耐力（E-RT组，方案：60%1RM，15RM，3组，组间间歇1 min）为目的的抗阻训练方案。于训练前、训练后即刻、训练后2 h和24 h测定表面标志物CX3CR1和annexin V表达量，检测CD4+、CD8+T淋巴细胞亚群迁移和凋亡（用阳性表达率表示）。结果：（1）CD4+T细胞：H-RT组运动后即刻和运动后24 h，annexin V和CX3CR1阳性表达率显著性升高（P<0.05）;E-RT组annexin V阳性表达率在运动后即刻降低（P<0.05），24 h显著性升高（P<0.05），CX3CR1阳性表达率仅在运动后即刻升高（P<0.05）。（2）CD8+T細胞：H-RT组和E-RT组运动后即刻和运动后24 h，annexin V和CX3CR1阳性表达率均显著性升高（P<0.05）。结论：CD4+T（而非CD8+T）淋巴细胞亚群对于急性抗阻训练的免疫反应存在运动方案依赖性。

关键词：抗阻训练;T淋巴细胞;免疫反应;迁移;凋亡

基金课题：连续高强度间歇运动对淋巴细胞凋亡和迁移的影响及机制。河南省科技厅科技攻关项目，项目号：182102310952。

中图分类号：G80       文献标识码 ：A     文章编号：1002-7475（2019）02-158-03

规律抗阻训练能够刺激肌肉产生生理适应以提高肌肉力量、爆发力、肌肉耐力并促进肌肉肥大，其效果与训练方案中运动方式、运动负荷、运动顺序、间歇时间等因素有关。多项研究针对抗阻训练对肌肉力量、肌肉功能、身体成分以及相关健康体适能参数的影响进行了深入阐释，然而抗阻训练对于免疫细胞迁移和凋亡至今知之甚少。既往的研究主要集中在高强度和/或离心运动（可造成肌肉损伤）对于免疫细胞应答的影响，甚至在训练方案上与实践脱节。Pereira等强调，探讨免疫系统对于急性运动反应与适应有助于设计科学合理的运动处方。

研究发现，运动能够诱导外周血淋巴细胞计数出现双相变化。运动开始时淋巴细胞快速动员入血，造成外周血淋巴细胞计数显著升高，运动后30 min～2 h外周血淋巴细胞计数低于安静水平（淋巴细胞减少症），6～24 h恢复。淋巴细胞减少部分原因与其凋亡（程序性细胞死亡）和/或迁移（淋巴细胞从循环池进入组织淋巴细胞池）有关。Annexin V（钙磷脂结合蛋白Ⅴ）是胞内蛋白annexin家族的一员，能够与磷脂酰丝氨酸结合，因此可作为识别凋亡细胞的表面标志物。此外，淋巴细胞可在循环池和淋巴细胞池之间自由迁移以维持免疫系统稳态。由于趋化因子CX3C受体1（CX3CR1）与其配体（CX3CL1）结合后介导淋巴细胞黏附与迁移，因此可通过CX3CR1表达而特异性甄别淋巴细胞迁移。Pereira等近期的一项研究显示，CD4+和CD8+T淋巴细胞在一次急性抗阻训练后24 h发生明显的迁移和凋亡，有趣的是，这一效应并不受抗阻训练过程中组间间歇时间的影响。Asano等针对未经训练者设计了三种抗阻训练方案分别用于促进肌肉肥大、改善肌肉耐力和提高最大肌力，结果发现，其他两种方案比较，促进肌肉肥大方案训练后血清肌酸激酶（肌肉损伤标志物）和乳酸浓度显著升高，而血糖则明显下降。然而不同方案急性抗阻训练对CD4+和CD8+T淋巴细胞亚群迁移和凋亡的影响鲜有关注。因此，本研究针对未经训练的青年，设计两种不同方案的抗阻训练，分别以促进肌肉肥大和以改善肌肉耐力为目的，观察训练前后CD4+和CD8+T淋巴细胞迁移和凋亡的变化并探讨其可能机制。我们推测，与改善肌肉耐力方案比较，促进肌肉肥大抗阻训练方案能够诱导T淋巴细胞迁移和凋亡标志物表达量明显上调。

1 研究对象和方法

1.1 受试对象

15名青年男性自愿参加本实验，其一般情况如表1所示。受试者身体健康、无免疫系统、心血管系统以及骨骼肌肉系统疾病，排除半年内使用药物、营养保健品者以及长期烟酒、咖啡嗜好者。通过问卷调查以及美国运动医学会分类标准，受试者无抗阻训练经历。实验前告知其实验目的、实验流程、运动风险，签订知情同意书。

1.2 整体实验设计

所有受试者共完成5次测试和4次取血，整体实验设计见图1所示。第1～2次：受试者了解实验流程，熟悉实验设备和抗阻训练器械的使用并进行人体测量学参数检测（包括年龄、身高、体重、体脂百分比、心率和血压，见表1）。第3次：72 h后进行1RM（最大重复次数，maximal repetitions）测试;第4～5次：1周后分别进行一次以促进肌肉肥大为目的的抗阻训练方案（resistance training protocol for muscle hypertrophy，H-RT组）和一次以改善肌肉耐力为目的的抗阻训练方案（resistance training protocol for muscle endurance，E-RT组），训练强度分别为70%1RM和60%1RM，两次训练之间间隔1周，受试者测试顺序采用随机原则。分别于训练前（Pre），训练后即刻（Post）、训练后2 h（Post-2h）和训练后24 h（Post-24h）取静脉血2 mL利用流式细胞仪通过测定表面标志物annexin V和CX3CR1表达量检测CD4+和CD8+T淋巴细胞迁移和凋亡。嘱受试者实验前2天保证充足睡眠并避免剧烈运动，实验前与实验过程中禁止吸烟，饮酒以及服用任何药物或营养补剂。

1.3 熟悉抗阻训练器械以及运动测试

受试者熟悉抗阻训练器械时，针对主要大肌肉群完成3组、每组10～12RM训练。72 h后进行1RM测试，即通过增减配重，受试者只能重复1次所对应的重量（kg），重复三次，取最高值。为减少测量误差，依照Inoue等的建议采取以下措施：（1）测试前充分熟悉器械的使用;（2）保证每次测试的程序和条件基本一致;（3）同一动作（肌肉群）三次测试间间隔5 min，下一动作开始测试前休息10 min;（4）上下肢肌肉测试轮流进行（即按照“上肢肌→下肢肌→上肢肌→下肢肌”顺序）;（5）测试时间在一天中的同一时间段进行，以避免生物节律的影响。

1.4 训练方案

受试者先进行10 min准备活动，包括5 min拉伸和5 min慢跑，然后根据ACSM推荐的方案分别进行一次H-RT或E-RT，训练强度分别为70%1RM和60%1RM，两次训练之间间隔1周。每次训练包含8个动作，顺序如下：胸部卧推（胸大肌）、坐姿下拉（背阔肌）、坐姿腿屈伸（股四头肌）、直立劃船（三角肌和斜方肌）、俯卧腿弯举（股二头肌）、三头肌下拉（肱三头肌）、站姿提踵（小腿三头肌）和哑铃弯举（肱二头肌），共完成3组。H-RT每组完成10次（10RM），相邻动作之间间歇1 min，组间间歇1.5 min;E-RT组每组完成15次（15RM），相邻动作之间以及组间间歇均为1 min;总时间约50～60 min。

1.5 外周血T淋巴细胞亚群计数以及细胞迁移与凋亡测定

分别于不同强度抗阻训练前（Pre），训练后即刻（Post）、训练后2 h（Post-2h）和训练后24 h（Post-24h）肘正中静脉取血2 mL，肝素抗凝，利用流式细胞仪（FACS 420型，美国BD公司）检测CD4+和CD8+T淋巴细胞计数以及迁移和凋亡。

取100 μL抗凝血，按照试剂盒说明与CD4-APCeFluor780和CD8-V500单克隆荧光抗体（购自武汉博士德生物工程有限公司）避光孵育30 min。加入2 mL红细胞裂解液，避光孵育20 min，300 g离心5 min。PBS缓冲液2 mL洗涤，离心5 min。流式细胞仪上机检测淋巴细胞亚群免疫表型分型以及CD4+和CD8+T淋巴细胞计数。

取200 μL全血与250 μL抗体混匀后在暗室中孵育30 min，300 g离心5～10 min，弃上清后加入2 mL红细胞裂解缓冲液裂解10 min，加入磷酸缓冲盐溶液后离心，上机检测。分别使用CX3CR1和annexin V单克隆抗体（购自武汉博士德生物工程有限公司）进行CD4+和CD8+T淋巴细胞迁移和凋亡测定（用阳性表达率表示）。

1.6 统计方法

使用SPSS 19.0统计软件包对数据进行统计分析，所有数据以“均数±标准差”表示。淋巴细胞迁移、凋亡分别用CX3CR1和annexin V的阳性表达率表示，抗阻训练后淋巴细胞计数、凋亡与迁移的变化以与训练前差值的变化率（△%）表示，即△%=（训练后值-训练前值）/训练前值×100%。组间（H-RT vs. E-RT）完成的总重复次数和总训练负荷比较使用独立样本t检验。组内（H-RT或E-RT）不同时间点（Post、Post-2h和Post-24 h）与训练前（Pre）比较以及同一时间点组间（H-RT vs. E-RT）使用卡方检验;组内比较时，当annexin V和CX3CR1阳性表达率与细胞计数变化率具有显著性差异时说明淋巴细胞凋亡和迁移的变化具有统计学意义。统计学差异定为P<0.05。

2 结果

2.1 不同强度抗阻训练时完成的总重复次数和总训练负荷比较

表2为不同强度抗阻训练时完成的总重复次数和总训练负荷（总次数×重量），其中E-RT组总重复次数和总训练负荷均显著性高于H-RT组（P<0.05）。

2.2 两组CD4+T和CD8+T细胞计数以及annexin V和CX3CR1阳性表达率的变化

H-RT组：运动后各时间点，CD4+T细胞计数无显著性变化（P>0.05）;运动后即刻以及24 h，CD4+T细胞annexin V和CX3CR1阳性表达率显著性升高（P<0.05），运动后2 h则无显著性差异（P>0.05）。运动后各时间点，CD8+T细胞计数无显著性变化（P>0.05）;运动后即刻、2 h以及24 h，CD8+T细胞annexin V和CX3CR1阳性表达率均显著性升高（P<0.05）。

E-RT组：运动后各时间点，CD4+T细胞计数无显著性变化（P>0.05）;CD4+T细胞annexin V阳性表达率在运动后即刻降低（P<0.05），24 h显著性升高（P<0.05）;CD4+T细胞CX3CR1阳性表达率仅在运动后即刻升高（P<0.05）;运动后2 h均无显著性差异（P>0.05）。运动后，CD8+T细胞计数显著性升高（P<0.05）;CD8+T细胞annexin V阳性表达率在运动后即刻、2 h和24 h均显著性升高（P<0.05）;CD8+T细胞CX3CR1阳性表达率仅在运动后即刻和24 h升高（P<0.05），运动后2 h则无显著性差异（P>0.05）。

组间比较，H-RT组CD4+T细胞annexin V阳性表达率在运动后即刻和24 h高于E-RT组（P<   0.05），CX3CR1阳性表达率在运动后即刻低于而运动后24 h高于E-RT组（P<0.05）;H-RT组CD8+T细胞annexin V阳性表达率在运动后2 h低于而24 h高于E-RT组（P<0.05），CX3CR1阳性表达率在运动后2 h高于E-RT组（P<0.05）。

3 讨论

本研究设计旨在促进肌肉肥大（70%1RM，H-RT组）以及增强肌肉耐力（60%1RM，E-RT组）的两种抗阻训练方案，其目的在于对比不同方案抗阻训练诱导外周血T淋巴细胞免疫反应的差异。我们假设，H-RT组诱导的T淋巴细胞迁移和凋亡理应显著高于E-RT组。本研究发现：

（1）抗阻训练后即刻，E-RT组CD4+T淋巴细胞迁移增加、凋亡下降，而H-RT组迁移和凋亡均显著性升高;

（2）抗阻训练后24 h，H-RT组CD4+T淋巴细胞凋亡迁移和凋亡显著性增加，而E-RT组仅凋亡增加;

（3）E-RT组和H-RT组训练后即刻以及训练后24 h，     CD8+T淋巴细胞迁移和凋亡均显著性升高。因此，本研究结果部分证实了前述假设，提示仅CD4+T淋巴细胞对于抗阻训练的反应具有运动方案依赖性。

对于CD4+T淋巴细胞，本研究发现，抗阻训练后即刻H-RT组迁移和凋亡标志物（CX3CR1和annexin V）表达量均显著上调，而E-RT组只有细胞迁移增加;训练后24 h，H-RT组迁移和凋亡仍处于较高水平，而E-RT组仅凋亡增加，提示CD4+T细胞对于急性抗阻训练的免疫应答反应存在运动方案依赖性，这与Navalta等和Pereira等的研究结果基本一致。然而Simpson等发现，一次急性下坡跑（肌肉离心运动）运动后淋巴细胞减少主要是由于细胞迁移造成的，而与细胞凋亡无关，研究结果不一致可能与运动模型不同有关。在Navalta等针对不同强度跑台运动的研究中，以76%最大摄氧量（maximal oxygen uptake，VO2max）运动后1 h细胞凋亡明显增加（运动后即刻无显著性变化），而运动强度为87%和100%时细胞迁移上调，提示中等强度运动诱导细胞凋亡，而高强度运动时由于细胞迁移显著增加从而将凋亡的CD4+T细胞从血循环中清除。这与本研究中E-RT组的结果类似，即抗阻训练后即刻CD4+T仅细胞迁移升高。Pereira等设计旨在促进肌肉肥大的抗阻训练方案（75%1RM，与本研究70%1RM接近）并对比不同组间间歇（1 min vs. 3 min）对CD4+T细胞迁移和凋亡的影响，结果发现，长间歇时（3 min）运动后即刻CD4+T细胞凋亡并无显著性该变，而短间歇（1 min）则诱导凋亡和迁移标志物均表达上调。Asano等以未经系统训练的青年男性为受试对象，设计与本研究相似的两种抗阻训练方案并对比不同训练方案对生理反应影响的差异，结果发现，肌肉肥大训练方案诱导的心血管反应（心率、血压）以及代谢标志物（血乳酸和肌酸激酶含量）均显著高于肌肉耐力训练方案。虽然本研究并未检测上述参数，然而可以推测，H-RT组诱导的机械和代谢应激理应高于E-RT组，进而对免疫系统产生更为深刻的作用。Krüger等的实验结果显示，以75%1RM强度进行一次急性抗阻训练后淋巴细胞凋亡率和血清皮质醇含量显著升高，体外细胞培养进一步证实，加入米非司酮（糖皮质激素受体拮抗剂）后凋亡率明显减轻，提示皮质醇-糖皮质激素受体依赖性信号途径参与并介导高强度抗阻训练诱导外周血淋巴细胞凋亡。多项研究均证实，皮质醇含量升高诱导淋巴细胞迁移和/或凋亡是运动后淋巴细胞减少的重要原因。Smilios等设计三种抗阻训练方案（最大力量、肌肉肥大和肌肉耐力）旨在探讨训练组数对于睾酮、皮质醇和生长激素（growth hormone，GH）的影响，结果发现，肌肉肥大训练方案诱导皮质醇和GH含量上调且高于其他两种方案。该研究在一定程度上部分解释了本研究中不同抗阻训练方案凋亡和迁移存在差异的原因。

关于CD8+T淋巴细胞，本研究发现，H-RT和E-RT组训练后即刻以及训练后24 h细胞凋亡和迁移均显著性升高。β-肾上腺素能受体（β-adrenergic receptor，β-AR）主要存在于细胞毒性T（如自然杀伤细胞和CD8+T）细胞，肾上腺素通过β-AR途径而动员淋巴细胞，肾上腺素灌注或使用β-肾上腺素能激动剂能够选择性上调细胞毒性T细胞β-AR表达，因此CD8+T细胞易受肾上腺素的调节，从而导致CD8+亚群对于运动应激的反应较CD4+亚群更为敏感。Navalta等等利用递增负荷力竭运动试驗证实，运动后即刻CD8+T细胞CX3CR1表达量上调，而annexin V则无显著性变化。研究结果存在差异可能与运动方式（有氧运动 vs. 抗阻训练）有关，而有氧运动和抗阻训练时机体承受运动应激的方式不同（持续性 vs. 间歇性）抑或是原因之一。Pereira等设计组间间歇为1 min和3 min的旨在促进肌肉肥大的训练方案并发现，训练后即刻CD8+T细胞凋亡和迁移均显著性增加。本研究对运动后恢复期多个时间点进行观察并进一步证实，训练后细胞凋亡与迁移在两组间并无显著性差异，提示CD8+T细胞对于不同抗阻训练方案存在相似的免疫应答反应。

4 结论、意义和展望

本研究结果提示，CD4+T细胞对于急性抗阻训练的反应存在运动方案依赖性。鉴于淋巴细胞不同亚群对于不同强度抗阻训练的免疫反应规律，可以推测，进行以促进肌肉肥大为目的的抗阻训练方案在运动后恢复期（24 h）能够同时抑制CD4+T和CD8+T细胞介导的免疫反应，进而降低该时期内其对于抗原刺激的敏感性，而以改善肌肉耐力为目的的抗阻训练方案诱导CD8+T细胞产生更为剧烈的免疫反应，上述规律为制定科学合理的抗阻训练处方提供了理论依据。今后的研究应进一步揭示本研究结果的临床意义，此外对于参训者特别是初学者在制定抗阻训练处方时应充分考虑运动诱导免疫反应这一因素，以避免或降低运动性免疫抑制的发生。

参考文献

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