环黄芪醇对庆大霉素诱导小鼠急性肾损伤的保护作用

王 位，马续祥，陈卫东

(蚌埠医学院第一附属医院肾内科，安徽 蚌埠 233000)

急性肾损伤是指肾功能在短时间内丧失，肾小管过滤功能降低，引起尿素和其他氮质代谢产物潴留、体内电解质紊乱的临床常见危重病[1]。急性肾损伤的病理生理学机制一般包括白细胞浸润、炎性因子产生与释放及自由基氧化等过程[2-3]。由于缺乏有效的治疗手段，急性肾损伤常常进展为慢性肾脏疾病，对患者的生活质量造成严重影响，且发病率与病死率较高。近年来，药物引起的急、慢性肾衰竭日益增多，肾毒性药物已成为导致急性肾损伤的重要病因之一，探寻预防和治疗急性肾损伤的药物具有重要意义。黄芪为豆科植物膜荚黄芪、蒙古黄芪等的干燥根，是传统补气中药，具有补气健脾、升阳固表等功效[4]。研究发现，黄芪可以改善急性肾损伤，对肾功能有保护作用，但其具体作用机制尚不明确[5]。环黄芪醇是从黄芪中提取的一种环菠萝烷型四环三萜类化合物，是黄芪药理作用的重要成分，具有增强机体清除氧自由基能力、抑制过氧化反应等功效。研究表明，环黄芪醇通过抑制氧化应激和肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)的过量产生，从而预防由医源性高胰岛素血症引起的肾损伤，说明环黄芪醇对肾损伤可以发挥保护作用[6-7]，但其具体作用机制尚不明确。本研究利用庆大霉素构建小鼠急性肾损伤模型，并采用梯度浓度环黄芪醇进行治疗，旨在探讨环黄芪醇对急性肾损伤小鼠肾功能的保护作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物6～8周龄雄性C57BL/6J小鼠30只，体质量(20±2)g，购自安徽省实验动物中心，合格证号：34000200001224。30只小鼠随机分为空白组、模型组及环黄芪醇低、中、高剂量组，每组6只。小鼠于无特定病原体级环境中饲养，12 h明暗交替，环境温度20～24 ℃，湿度45%～55%，自由摄食和饮水。本实验及相关操作均经蚌埠医学院动物伦理委员会批准。

1.2 主要试剂与仪器环黄芪醇购自西安优硕生物科技有限公司，超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、还原性谷胱甘肽(glutataione，GSH)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)、肌酐(creatinine，CRE)、尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)测试盒购自南京建成生物有限公司，多聚甲醛、苏木精-伊红(hematoxylin-eosin，HE)染色试剂、过碘酸希夫(periodic acid-schiff，PAS)染色试剂购自北京索莱宝科技有限公司，乙醇、二甲苯购自上海国药集团化学试剂有限公司，放射免疫沉淀(radio-immunoprecipitation,RIPA)裂解液、磷酸盐缓冲液(phosphate buffer saline,PBS)购自博士德生物工程有限公司；SpectraMax190 型全波长酶标仪购自美国MD公司，5415R高速冷冻离心机购自德国Eppendorf公司，石蜡切片机、石蜡包埋机、脱水机购自德国Leica公司，荧光倒置显微镜购自日本Olypus公司。

1.3 小鼠急性肾损伤模型制备模型组及环黄芪醇低、中、高剂量组小鼠腹腔注射适量庆大霉素(100 mg·kg-1)，每日1次，连续7 d；同时，环黄芪醇低、中、高剂量组小鼠分别按200、400、800 mg·kg-1的剂量给予环黄芪醇灌胃，每日1次，连续7 d；空白组和模型组小鼠灌胃等量生理盐水。各组小鼠均于造模第7天给药后当晚禁食、水，造模第8日经眶内静脉采血，然后采用颈椎脱臼法处死小鼠，剖腹取双侧肾脏用于后续实验。

1.4 各组小鼠血清BUN、CRE、SOD、MDA、GSH水平测定各组小鼠均于造模后第8日经眶内静脉采血1 mL，静置15 min 后，1 500 r·min-1离心 10 min 取上清液，按照相应试剂盒说明书操作，使用酶标仪通过比色法测定血清BUN、CRE、SOD、MDA和GSH水平。

1.5 各组小鼠肾组织形态学观察眶内静脉采血后处死小鼠，剖腹取左侧肾脏，生理盐水冲洗，40 g·L-1多聚甲醛溶液固定48 h，采用梯度乙醇脱水，二甲苯固定，石蜡包埋切片(层厚5～8 μm)，进行常规HE染色和PAS染色，中性树胶封片，显微镜下观察小鼠肾组织病理学表现。

1.6 各组小鼠肾组织中SOD、MDA、GSH 水平测定各组小鼠分别取右侧肾组织0.2 g，加入1 mL RIPA裂解液，在冰盒上用玻璃匀浆器研磨，12 000 r·min-1离心15 min，取上清液提取总蛋白。按照试剂盒的步骤使用酶标仪在550 nm处通过比色法测定肾组织匀浆中SOD、MDA、GSH 水平。

1.7 酶联免疫吸附试验检测各组小鼠肾组织中单核细胞趋化蛋白-1(monocyte chemotactic protein 1,MCP-1)和肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)水平取0.15 mL肾组织蛋白加入到酶标板中，先加等体积的双蒸水稀释，再每孔加入 0.3 mL 酶标抗体工作液，37 ℃暗处孵育60 min,蒸馏水洗涤3次，采用自动酶标仪在450 nm处检测吸光度值，通过比色法计算各组小鼠肾组织中 MCP-1、TNF-α水平。

2 结果

2.1 各组小鼠肾组织病理学表现结果见图1和图2。HE染色显示，空白组小鼠肾小管管壁呈充盈状态，细胞质丰富，细胞核蓝色深染(图1A)；模型组小鼠肾小管上皮细胞大部分受损坏死，细胞质大量减少，部分细胞的细胞核变大，间质充满炎性细胞(图1B)；环黄芪醇低剂量组小鼠部分肾小管上皮细胞溶解消失，间质有炎性细胞浸润，肾小管集中区域有网状改变，与模型组小鼠比较肾组织病理情况有所改善(图1C)；环黄芪醇中、高剂量组小鼠肾小管上皮细胞基本完整，管壁变薄，细胞质减少，与模型组小鼠比较肾组织病理情况明显改善(图1D、图1E)。PAS染色显示，空白组小鼠基底膜结构完整，着色较浅(图2A)；模型组小鼠肾组织肾小球内系膜红色深染，基底膜增厚，提示肾小球内糖原大量沉积，损伤严重(图2B)；环黄芪醇低、中、高剂量组小鼠基底膜与空白组比较均有所增厚，但与模型组比较有改善，肾小球的糖原沉积也明显减少，肾组织的病理情况显著好转(图2C、图2D、图2E)。

A:空白组；B：模型组；C：环黄芪醇低剂量组；D：环黄芪醇中剂量组；E：环黄芪醇高剂量组。

图1 各组小鼠肾组织病理变化(HE染色,×200)

Fig.1 Pathological changes of kidney tissues of mice in each group(HE staining,×200)

A:空白组；B：模型组；C：环黄芪醇低剂量组；D：环黄芪醇中剂量组；E：环黄芪醇高剂量组。

图2 各组小鼠肾组织病理变化(PAS染色,×200)

Fig.2 Pathological changes of kidney tissues of mice in each group(PAS staining,×200)

2.2 各组小鼠血清BUN、CRE、SOD、MDA、GSH水平比较结果见表1。与空白组比较，模型组及环黄芪醇低、中、高剂量组小鼠血清BUN、CRE、MDA 水平显著升高，SOD 和 GSH 水平显著降低，差异均有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较，环黄芪醇低、中、高剂量组小鼠血清 BUN、CRE、MDA水平显著降低，SOD、GSH水平显著升高，差异均有统计学意义 (P<0.05)。与环黄芪醇低剂量组比较，环黄芪醇中、高剂量组小鼠血清 BUN、CRE、MDA水平显著降低，SOD、GSH水平显著升高，差异均有统计学意义 (P<0.05)。与环黄芪醇中剂量组比较，环黄芪醇高剂量组小鼠血清 BUN、CRE、MDA水平显著降低，SOD、GSH水平显著升高，差异均有统计学意义 (P<0.05)。

表1 5组小鼠血清BUN、CRE、SOD、MDA、GSH水平比较

组别nBUN/(mmol·L-1)CRE/(μmol·L-1)SOD/(ng·L-1)MDA/(μmol·L-1)GSH/(mg·L-1)空白组67.58±0.82 42.30±3.72 122.68±10.52 4.92±0.32 254.36±15.63 模型组624.46±3.02a77.67±6.67a78.58±6.78a6.52±0.54a176.48±26.34a环黄芪醇低剂量组622.17±1.67ab75.75±3.26ab85.86±12.03ab6.13±0.13ab192.33±18.36ab环黄芪醇中剂量组616.47±2.38abc71.28±3.12abc91.25±14.32abc5.87±0.06abc208.13±19.54abc环黄芪醇高剂量组68.64±1.75abcd51.59±4.07abcd106.16±8.97abcd5.33±0.11abcd221.56±14.65abcd

注：与空白组比较aP<0.05；与模型组比较bP<0.05；与环黄芪醇低剂量组比较cP<0.05；与环黄芪醇中剂量组比较dP<0.05。

2.3 各组小鼠肾组织中SOD、MDA、GSH、MCP-1及TNF-α水平比较结果见表2。与空白组比较，模型组及环黄芪醇低、中、高剂量组小鼠肾组织MDA水平显著升高，SOD、GSH水平显著降低，差异有统计学意义 (P<0.05)。与模型组比较，环黄芪醇低、中、高剂量组小鼠肾组织MDA水平显著降低，SOD、GSH水平显著升高，差异有统计学意义(P<0.05)。与环黄芪醇低剂量组比较，环黄芪醇中、高剂量组小鼠肾组织MDA水平显著降低，SOD、GSH水平显著升高，差异有统计学意义(P<0.05)。与环黄芪醇中剂量组比较，环黄芪醇高剂量组小鼠肾组织MDA水平显著降低，SOD、GSH水平显著升高，差异有统计学意义(P<0.05)。

与空白组比较，模型组及环黄芪醇低、中、高剂量组小鼠肾组织中MCP-1、TNF-α水平显著升高，差异有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较，环黄芪醇低、中、高剂量组小鼠肾组织中MCP-1、TNF-α水平均显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)。与环黄芪醇低剂量组比较，环黄芪醇中、高剂量组小鼠肾组织中MCP-1、TNF-α水平显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)；与环黄芪醇中剂量组比较，环黄芪醇高剂量组小鼠肾组织中MCP-1、TNF-α水平显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)。

表2 5组小鼠肾组织中SOD、MDA、GSH、MCP-1和TNF-α水平比较

组别nSOD/(U·mg-1 pro)MDA/(mmol·g-1 pro)GSH/(mg·L-1)MCP-1/(μmol·g-1)TNF-α/(μmol·g-1)空白组6152.72±15.68 7.31±0.42 376.58±48.35 6.72±1.98 2.18±1.02 模型组691.68±19.87a12.65±0.84a216.36±43.67a24.62±3.69a6.89±1.35a低剂量组695.86±15.14ab11.13±0.58ab236.23±51.26ab19.78±2.53ab5.14±0.97ab中剂量组6130.52±12.42abc10.86±1.12abc281.13±49.57abc14.02±1.97abc4.51±0.84abc高剂量组6142.56±13.77abcd9.03±0.84abcd315.36±39.42abcd9.18±2.03abcd3.24±1.14abcd

注：与空白组比较aP<0.05；与模型组比较bP<0.05；与环黄芪醇低剂量组比较cP<0.05；与环黄芪醇中剂量组比较dP<0.05。

3 讨论

急性肾损伤是一种由多种复杂原因导致的临床综合征，目前，其具体发病机制尚不明确，可能有以下几种：(1)通过炎性因子途径介导急性肾小球肾炎；(2)通过肾小管毒性致急性肾小管坏死；(3)影响肾脏的血流动力学，使肾脏血流灌注减少，造成肾损伤[8-10]。急性肾损伤的病因包括药物因素、手术因素、慢性疾病等。药物因素是导致急性肾损伤的首位病因，其中以氨基糖苷类药物最常见[11-12]。庆大霉素是一种疗效确切的氨基糖苷类抗生素，能够作用于细菌体内的核糖体，从而抑制细菌的蛋白质合成，并可破坏细菌细胞膜的完整性，主要用于治疗革兰阴性菌引起的感染，但其肾毒性一直受到关注。庆大霉素的水溶性较高，但血浆蛋白结合率较低，在体内几乎无法进行代谢转化，只能以原形从肾脏排泄，当庆大霉素进入肾脏近曲小管上皮细胞时容易蓄积，从而损伤细胞内的多种细胞器，使细胞变性坏死，肾脏功能紊乱；同时，庆大霉素还可以抑制线粒体的功能，产生氧代谢产物，引起肾组织损伤。

黄芪为传统中草药，具有补中益气、健脾利水的作用，临床用于治疗糖尿病肾病、慢性肾炎蛋白尿。有文献报道，黄芪能减少尿蛋白，改善肾功能，并可以减轻小管间质纤维化[13]。环黄芪醇是从黄芪中提取的中药单体,具有较好的药理活性，研究表明，环黄芪醇可以改善急性肾损伤[7]。近年来，药物引起的急、慢性肾衰竭日益增多，探寻预防和治疗急性肾损伤的药物具有重要意义。因此，本研究通过制备庆大霉素诱导的小鼠急性肾损伤模型，并给予环黄芪醇干预，以探讨环黄芪醇对庆大霉素诱导小鼠急性肾损伤的保护作用及其机制。

本研究中，小鼠肾组织病理组织学观察显示，空白组小鼠基底膜结构完整，肾小管管壁充盈，细胞结构正常；模型组小鼠基底膜增厚，肾小球内糖原大量沉积，损伤严重，肾小管上皮细胞大部分受损坏死，间质充满炎性细胞，且模型组小鼠血清BUN、CRE水平显著高于空白组，说明庆大霉素导致小鼠发生急性肾损伤。环黄芪醇低、中、高剂量组小鼠基底膜与空白组比较均有所增厚，但与模型组比较有改善，肾小管上皮细胞损伤明显减轻，肾小球的糖原沉积也明显减少，肾组织的病理情况明显改善，且血清BUN、CRE水平较模型组显著降低，说明环黄芪醇能够改善庆大霉素导致的小鼠急性肾损伤。

氧自由基反应和脂质过氧化反应在机体内处于平衡状态，维持体内的新陈代谢。当体内氧化和抗氧化功能失衡时，会发生中性粒细胞炎性浸润，大量氧化中间产物生成，从而导致组织损伤。有研究表明，庆大霉素导致的急性肾损伤与氧化应激反应有关[14]。SOD和GSH是人体内重要的酶抗氧化系统的主要成员，MDA则是机体内重要的脂质过氧化代谢产物。本研究通过检测比较庆大霉素诱导急性肾损伤小鼠血清和肾组织中MDA、SOD和GSH水平，观察小鼠肾组织脂质过氧化程度和细胞氧化损伤情况，结果显示，与空白组比较，模型组及环黄芪醇低、中、高剂量组小鼠血清及肾组织中MDA水平显著升高，SOD和GSH水平显著降低，说明庆大霉素导致了小鼠肾组织氧化应激损伤；与模型组比较，环黄芪醇低、中、高剂量组小鼠血清及肾组织中MDA水平显著降低，SOD、GSH水平显著升高，且随着环黄芪醇剂量的增加，环黄芪醇低、中、高剂量组小鼠血清及肾组织中MDA水平逐渐降低，SOD、GSH水平逐渐升高，提示环黄芪醇可以有效降低小鼠氧自由基生成，缓解氧化应激情况，改善肾组织细胞氧化性损伤程度，通过改善小鼠体内氧化应激反应而对急性肾损伤发挥保护作用。

炎症反应在急性肾损伤发生、进展过程中也发挥重要作用。研究发现，损伤的肾小管上皮细胞会通过释放MCP-1、TNF-α等炎性因子参与炎症细胞的趋化与活化过程，导致炎症反应加重[8]。与空白组比较，模型组及环黄芪醇低、中、高剂量组小鼠肾组织中炎性因子MCP-1、TNF-α水平显著升高；与模型组比较，环黄芪醇低、中、高剂量组小鼠肾组织中MCP-1、TNF-α水平显著降低；且随着环黄芪醇剂量的增加，环黄芪醇低、中、高剂量组小鼠肾组织中MCP-1、TNF-α水平显著降低；说明环黄芪醇可以有效降低急性肾损伤小鼠肾组织中的炎性因子水平，从而对急性肾损伤发挥保护作用。

综上所述，环黄芪醇可以显著降低急性肾损伤小鼠血清CRE、BUN水平，并有效改善病理症状；另一方面，可以使急性肾损伤小鼠血清和组织中MDA水平显著降低，SOD、GSH水平显著升高，改善肾组织氧化性损伤程度；并显著降低小鼠肾组织中 MCP-1、TNF-α水平，改善肾脏炎症反应。但急性肾损伤病因尚不明确，环黄芪醇是否还通过其他途径干预这一过程，尚需要进一步研究。