胸段硬膜外阻滞对急性心肌梗死大鼠心肌细胞凋亡的影响

胡淋淋，马闻苛，李晓芳，张红伟，樊 腾，杨明月，徐璐丹，张文杰，岳修勤

(新乡医学院第一附属医院麻醉科,河南 卫辉 453100)

急性心肌梗死是一种由于冠状动脉急性闭塞或狭窄导致的急性心血管疾病，患者多表现为长时间的压榨样胸骨后疼痛伴窒息感，休息或口服硝酸酯类药物不能有效缓解，伴有血清心肌酶水平增高及动态性心电图变化，可并发恶性心律失常、心源性休克及心力衰竭，治疗不及时常导致患者猝死[1]。急性心肌缺血后如何更好地保护缺血心肌，降低围术期病死率，是目前临床研究热点。胸段硬膜外阻滞是临床上常用的椎管内麻醉方法之一，通过胸段硬膜外阻滞可以阻断心脏交感神经，减少交感神经末梢儿茶酚胺类的释放，使有病变的冠状动脉血管管径扩张，增加缺血心肌血液供应，进一步减少心肌缺血梗死引起的心肌细胞凋亡[2]。本实验通过检测大鼠心肌组织中凋亡蛋白Caspase-3活性，观察胸段硬膜外阻滞对急性心肌梗死时心肌细胞凋亡的保护作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物选取8～10周龄清洁级健康雄性Wistar 大鼠50只(购于郑州大学实验动物中心)，体质量(300±20)g，大鼠之间体质量差异无统计学意义(P>0.05)；排除急性心肌梗死后或硬膜外给药后死亡大鼠14例，实际纳入36例。

1.2 主要试剂与仪器大鼠心肌肌钙蛋白I(cardiac troponin I,cTnI)酶联免疫检测试剂盒购自南京森贝加公司，β-actin抗大鼠单克隆一抗、辣根过氧化物酶标记二抗购自美国Jackson Immuno Research公司，放射免疫沉淀测定(radio-Immunoprecipitation assay,RIPA)裂解液、苯甲基磺酰氯(phenylmethanesulfonyl fluoride,PMSF)、聚氰基丙烯酸正丁酯(bicinchoninic acid,BCA)蛋白定量试剂盒、聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gelelectrophoresis,SDS-PAGE)蛋白上样缓冲液2×、上样缓冲液(6×Loading Buffer)、四甲基乙二胺(tetramethylethylenediamine,TEMED)购自武汉博士德生物工程有限公司，焦碳酸二乙酯(diethyl pyrocarbonate,DEPC)购自北京索莱宝科技有限公司，丽春红染液购自上海碧云天生物技术研究所，脱脂奶粉购自美国Amresco公司，胎牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)购自韩国Biosharp公司；尼康普通双目显微镜购自上海普赫光电科技有限公司，RGZ-120型体重计购自河南曙光健士医疗器械集团股份有限公司，多功能生物信息采集系统、小动物呼吸机购自上海奥尔科特生物科技公司，Mini ProTEBn 3 Cell小型垂直电泳仪、半干式转膜系统购自北京君意东方电泳设备有限公司，聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride,PVDF)膜购自武汉博士德生物工程有限公司，96孔板购自美国Corning Costar公司，扫描仪购自爱普生有限公司，普通高速离心机、-80 ℃超低温冰箱、全波长扫描酶标仪购自美国Thermo Scientific公司，37 ℃恒温培养箱购自德国Heraeus公司。

1.3 实验分组和各组干预措施将36只大鼠随机分为假手术组、模型组和罗哌卡因组，每组12只。造模前各组大鼠硬膜外腔置管，罗哌卡因组大鼠经硬膜外腔注入5 g·L-1罗哌卡因(0.125 mL·kg-1)进行胸段硬膜外阻滞[3]，假手术组和模型组大鼠硬膜外腔注入等量生理盐水。罗哌卡因组大鼠给药5～6 min 后若出现心率减慢，平均动脉压(mean arterial pressure，MAP)下降，大鼠眼睑下垂，胸前阻滞区域体表温度升高，胸腹部肌肉松弛，即判定为胸段硬膜外阻滞成功。

胸段硬膜外阻滞成功后，罗哌卡因组、模型组大鼠采用结扎左冠状动脉前降支的方法[4-6]制备急性心肌梗死模型，假手术组大鼠仅穿线不结扎左冠状动脉前降支。结扎后大鼠左心室前壁颜色变苍白、心电图出现ST-T融合抬高，提示造模成功。

1.4 各组大鼠心电图及血流动力学监测在大鼠四肢安装心电图导联，连接多功能生物信号采集系统，记录开胸前(T0)、冠状动脉结扎前(T1)、冠状动脉结扎后3 h(T2)各组大鼠心率(heart rate，HR)、心电图走势及MAP。

1.5 酶联免疫吸附试验检测各组大鼠血清cTnI水平分别于T0、T1、T2时取大鼠动脉血0.5 mL，室温静置20 min，1 000×g离心20 min，取血清,应用双抗体夹心酶联免疫吸附试验法测定cTnI水平。

1.6 Western blot法检测各组大鼠心肌组织中Caspase-3蛋白表达取梗死区心肌组织，液氮冷冻后-80 ℃保存待测。取100 mg冷冻心肌组织，剪碎后按照1 mg组织加入20 μL裂解液的配比，使用组织研磨器将组织粉碎，冰上裂解40 min，4 ℃下12 000×g离心20 min，取上清液。采用二喹啉甲酸(bicinchoninic acid,BCA)法测定蛋白浓度，加入5×loading buffer把样品调成相同浓度，沸水中煮5 min变性。蛋白变性后将其加样于聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，湿转至PVDF膜，含50 g·L-1脱脂奶粉的洗涤缓冲液室温封闭2 h。TBST洗膜2次，每次 10 min，然后加入稀释后的一抗，4 ℃温育过夜，洗涤缓冲液摇洗3次，每次10 min，加入稀释后的二抗，孵育2 h。使用拍照成像系统显像拍照，用Image-Pro Plμs6.0图像分析软件测定蛋白灰度值，以目的蛋白与内参蛋白β-actin灰度值的比值作为蛋白相对表达量。

2 结果

2.1 3组大鼠HR和MAP比较结果见表1。假手术组大鼠T0、T1、T2时HR、MAP两两比较差异均无统计学意义(P>0.05)；模型组和罗哌卡因组大鼠HR、MAP在T2时显著低于T0、T1时，差异有统计学意义(P<0.05)；模型组和罗哌卡因组大鼠HR、MAP在T0、T1时比较差异无统计学意义(P>0.05)。3组大鼠T0、T1时HR、MAP比较差异均无统计学意义(P>0.05)；T2时，模型组和罗哌卡因组大鼠HR、MAP显著低于假手术组，差异有统计学意义(P<0.05)；罗哌卡因组大鼠HR、MAP显著高于模型组，差异有统计学意义(P<0.05)。

表1 3组大鼠HR和MAP比较

组别nHR/(次·min-1)MAP/mmHg假手术组12 T0434.72±4.95106.76±10.57 T1431.64±5.15105.78±11.88 T2438.76±4.8799.85±7.96模型组12 T0432.68±5.05104.58±8.68 T1433.56±5.04106.56±8.55 T2372.11±4.74ab74.36±5.04ac罗哌卡因组12 T0435.87±4.45105.35±11.89 T1430.63±4.85104.47±12.78 T2399.85±5.15abc90.87±6.56abc

注：与同组T0、T1时比较aP<0.05；与假手术组比较bP<0.05；与模型组比较cP<0.05；1 mmHg=0.133 kPa。

2.2 3组大鼠血清cTnI水平比较结果见表2。假手术组大鼠血清cTnI水平在T0、T1、T2时比较差异均无统计学意义(P>0.05)；模型组和罗哌卡因组大鼠血清cTnI水平在T2时显著高于T0、T1时，差异有统计学意义(P<0.05)；模型组和罗哌卡因组大鼠血清cTnI水平在T0和T1时比较差异无统计学意义(P>0.05)。T0、T1时，3组大鼠血清cTnI水平比较差异均无统计学意义(P>0.05)；T2时，模型组和罗哌卡因组大鼠血清cTnI水平显著高于假手术组,差异有统计学意义(P<0.05)；T2时，罗哌卡因组大鼠血清cTnI水平显著低于模型组,差异有统计学意义(P<0.05)。

表2 3组大鼠血清cTnI水平比较

组别ncTnI /(μg·L-1)T0T1T2假手术组1214.85±1.5715.31±2.1415.56±1.76模型组1214.46±1.2814.45±3.2625.76±1.42ab罗哌卡因组1214.67±1.2914.63±3.2420.15±1.39abc

注：与同组T0、T1时比较aP<0.05；与假手术组比较bP<0.05；与模型组比较cP<0.05。

2.3 3组大鼠心肌组织中Caspase-3蛋白相对表达量比较假手术组、模型组和罗哌卡因组大鼠心肌组织中Caspase-3蛋白相对表达量分别为0.62±0.02、0.95±0.06、0.85±0.04，罗哌卡因组、模型组大鼠心肌组织中Caspase-3蛋白表达水平显著高于假手术组，差异有统计学意义(P<0.01)；罗哌卡因组大鼠心肌组织中Caspase-3蛋白表达水平低于模型组，差异有统计学意义(P<0.05)。

3 讨论

cTnI仅存在于心房和心室，与骨骼肌无交叉反应，特异性很强[7]。心肌细胞膜完整时cTnI不能渗出，当心肌细胞因缺血、缺氧，细胞膜的完整性受到破坏时，cTnI通过受损的细胞膜渗出进入血管，其在血清中水平可达正常值的20～50倍，明显高于其他酶类，在血清中持续时间较肌酸激酶同工酶杂化型更长。cTnI在AMI发生后2～4 h即升高，14～20 h 时达到高峰值，5～7 d恢复正常，敏感性非常高[8]。本实验中发现，结扎大鼠左冠状动脉前降支3 h后，模型组和罗哌卡因组大鼠血清cTnI水平较假手术组明显升高，而罗哌卡因组大鼠给予罗哌卡因胸段硬膜外干预后，血清cTnI水平较模型组明显降低，说明结扎大鼠左冠状动脉前降支后，大鼠心肌确实存在缺血性损伤，而胸段硬膜外干预对缺血心肌有一定的保护作用。

有研究表明，胸段硬膜外麻醉可降低HR、全身血管阻力和心肌梗死面积，保护心功能，增加心内膜和心外膜血流[9]。本研究结果显示，硬膜外麻醉后大鼠MAP有轻微下降，HR无明显变化。胸段硬膜外阻滞阻断起源于胸上段的心脏传入神经和交感传出神经，阻止心脏应激神经反射和抑制去甲肾上腺素诱发的急性心肌缺血，有助于减少心肌细胞凋亡，心肌细胞凋亡是心肌持续性缺血导致心肌损伤的一种主要形式。细胞凋亡和坏死可能导致心肌梗死面积扩大。有研究报道，在心外膜主要动脉闭塞后，细胞凋亡可能是早期心肌损伤的主要形式，而坏死可能成为心肌梗死的主要原因[10]。

本研究结果发现，冠状动脉结扎3 h后，罗哌卡因组大鼠心肌组织中Caspase-3蛋白的相对表达量较模型组明显下降，说明硬膜外干预对结扎冠状动脉诱发的心肌缺血性损伤有一定的保护作用。胸段神经阻滞可导致心脏的后负荷循环和外周阻力减少，这可能有助于改善冠状动脉循环和心脏功能。然而，在冠状动脉永久闭塞后，循环和冠状动脉灌注压的改变以及局部麻醉药的直接作用对缺血心肌的影响较小，而心肌代谢可能在其中发挥更大的作用。心肌细胞缺血后发生凋亡的机制可能与代谢、神经、内分泌有关。冠状动脉循环障碍后心肌的无氧代谢可引发连锁反应，可能导致交感神经系统活性上调和儿茶酚胺在心肌中的大量释放。心肌缺血后，血液供应中断，在细胞内腺嘌呤核苷三磷酸分解产生腺苷；厌氧代谢使氢离子聚积，细胞内钙离子超载[11]，其他离子运输机制也受到影响，代谢性化学物质导致心脏神经末梢和皮层受到刺激而产生传入神经冲动增加的变化，反射性地引起交感神经系统兴奋，儿茶酚胺释放增加。研究表明，在急性心肌缺血早期心肌组织中儿茶酚胺浓度过高会导致心肌细胞凋亡[12-13]。过度释放的去甲肾上腺素，通过激活心肌细胞β-肾上腺素能受体，增加细胞内环化腺核苷一磷酸水平，磷酸化的L-型钙通道和细胞内钙离子浓度增加，增强心肌细胞凋亡[14]。

硬膜外阻滞不仅在缺血性心脏病治疗中应用广泛，在心脏手术、胸科手术等重大手术应激诱发的心肌损伤保护方面也有独特的优势。对冠状动脉硬化性心脏病患者的研究发现，硬膜外阻滞可扩张粥样硬化的冠状动脉血管，提高冠状动脉搭桥术后患者左心室的收缩功能[15]，降低血清中cTnI水平，降低术后心肌缺血的发生率，胸段硬膜外麻醉还可激活缺血心肌组织内抗凋亡机制，上调心肌组织内抗凋亡蛋白Bcl-2的含量和抑制线粒体释放细胞色素C和细胞凋亡诱导因子[16],减少心肌细胞凋亡。在大鼠和兔缺血再灌注动物模型的实验中证明，Caspase家族的三肽抑制剂能够减少心肌梗死面积[17]。改善心肌血供，维持循环稳定，保证足够数量的心肌收缩细胞是缺血性心血管疾病治疗的最终目标。胸段硬膜外阻滞通过直接扩张狭窄的冠状动脉来降低血管阻力，减少心肌氧耗。在氧供一定的前提下，降低心肌氧耗是保护心肌的主要措施。

综上所述，胸段硬膜外阻滞能够减轻AMI后的心肌细胞凋亡，对缺血或梗死心肌有一定的保护作用;其机制可能与抑制心交感神经过度兴奋，减少儿茶酚胺类释放，缓解冠状动脉痉挛，增加心肌氧供有关。